分子生物学第六章-分子生物学操作技术二

第六章分子生物学操作技术二1第六章分子生物学操作技术二——基因功能研究技术2本章内容第一节基因表达研究技术第二节基因功能研究策略第三节蛋白质及RNA相互作用技术第四节基因芯片及数据分析第五节其他分子生物学技术第六节功能基因组学3大规模分析基因表达水平因为EST是从某一特定组织的cDNA文库中随机测序而得，所以可用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特定组织的基因表达谱。基因表达系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE）。SAGE是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法。DNA微阵列或基因芯片的研究。高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。4第一节基因表达研究技术一、基因表达系列分析技术（SAGE）SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。5常规SAGE方法（shortSAGE）基本流程67SAGE技术流程8基因芯片技术流程二、RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体9选择性剪切的不同类型RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切10三、原位杂交技术原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。11荧光原位杂交（FISH）首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。12四、基因定点突变技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。13寡核苷酸介导的DNA突变技术14重叠延伸介导的定点诱变大引物诱变法15五、其它研究基因表达技术实时荧光定量PCRNorthern、Southernblotting……16第二节基因功能研究策略抑制基因表达观察功能变化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法1718基因敲除又称基因打靶（genetargeting）将一段无关DNA片段取代某一特定基因是最简便的基因失活的方法。主要原理：在一段无关DNA片段的两侧连接与代换基因两侧相同的序列，将这一构建导入目的细胞，由于同源片段之间的重组，可使无关片段取代靶基因，整合到染色体中。为了便于筛选，用于取代的外源DNA中含有报告基因。一、基因剔除（knock-out)基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。19用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验20正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞21高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。2223tk胸苷激酶标记基因←gangcyclovir（GCV）neor新霉素抗性基因→G418232424模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。25植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。26植物基因敲除及突变体筛选a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。

b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。27二、基因过表达用于功能检测

通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达，致使受体表现出生长与发育的异常，来研究基因的功能。28三、反义技术

反义核酸技术主要是引入目的基因mRNA的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交而阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列互补配对后，用于表达目的基因的mRNA量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少。2930反义RNA作用机理：

A干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。

B与mRNA的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。

C反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板，转录终止。31RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。四、RNA干扰322006NobelPrize

生理学（医学奖)RNAinterference“沉默”是金33RNAi的发现1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA以期观察到基因表达的增强。结果:

二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。34RNAi的提出直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。

35RNAi现象的发现线虫（C.elegans)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA36RNAi广泛存在于自然界随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

37体外实验结果的提示体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。38RNAi作用的简单模型当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2、RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。

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RNA干扰的作用机制

长片段dsRNA在细胞内被Ⅲ型RNA酶Dicer切成长度大约为21-23bp的小片段干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），由siRNA参与构成复合物RISC（RNA-inducedsilencecomplex）。siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。40dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA41RNAi研究的一般技术路线42RNAi的生物学意义：一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御，有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。一种抗病毒感染机制。43RNAi技术的优缺点RNAi最根本的特点是特异性RNAi具有特殊的穿越能力，如将双链RNA注射在线虫性腺里，它也会干扰到体细胞里的基因表达，而且干扰作用会传给后代。RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显，而且几个有相同或相似序列的基因，RNAi也会同时作用于它们。44RNA干扰的应用

1、研究基因功能的新工具；2、病毒性疾病的治疗；3、遗传性疾病的治疗；4、肿瘤病的治疗第三节蛋白质及RNA相互作用技术一、酵母单杂交系统酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编码基因。将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。45从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。

酵母单杂交的基本原理示意图46二、酵母双杂交系统真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（bindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。4748ReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomainGeneBindingDomainActivationDomain正常条件下Y2H中

酵母双杂交的基本原理示意图49三、体外蛋白质相互作用技术1、FarWestern印迹技术Far-westernblotting是一种基于westernblotting的一种分子生物学方法。在Westernblotting中用抗体来检测目标蛋白，而在Far-Westernblotting中用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质。因此，Westernblotting用来检测特定的蛋白，而Far-westernblotting则用于检测蛋白质之间的相互作用。用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。502、GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。513、蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。524、等离子表面共振技术（surfaceplasmonresonancetechnology,SPR）将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。535、免疫共沉淀技术co-immunoprecipitation免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。基本原理：在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。545、免疫共沉淀技术co-immunoprecipitation将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。55丝状噬菌体基因基因编码产物功能gIpI噬菌体装配gIIpII噬菌体基因组复制gIIIpIII尾端外壳蛋白，与F因子结合gIVpIV噬菌体装配gVpV噬菌体基因组复制gVIpVI外壳蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外壳蛋白，高度疏水，组装起始信号gVIIIpVIII主要外壳蛋白gIXpIX外壳蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII启动子激活蛋白6、噬菌体展示技术565758建库5960四、细胞内蛋白质相互作用研究

——荧光共振能量转移法（FRET）

当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET;随着距离延长，FRET呈显著减弱。61四、细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离（1～10nm）；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。62第四节基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析基因芯片（DNAchip），又称DNA微阵列（DNAmicroarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。63基因芯片及数据分析简易基因芯片使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。64第五节其他分子生物学技术一、凝胶滞缓实验凝胶滞缓试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。65EMSA实验拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力。66二、蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。6768第六节功能基因组学MetabolomeProteomeTranscriptomeGenomeMetabonomicsMetabolomicsProteomicsTranscriptomicsGenomicsGenotypeMolecularPhenotypeMetabotype“Omics”WorldSystems

Biology69

InformationComplexityTheGeneticCodemetabolitesProteinSequencingtheGenomeisJusttheBeginningofanInformationWaveDNA/RNAPhenotype后基因组时代的生命科学研究70一、转录组学（Transcriptomics）1997年，Velculescu和Kinzler提出转录组概念转录组（transcriptome）：一个细胞内的一套mRNA转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功能）状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。这一研究领域叫转录组学（transcriptomics）。71基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray72转录组学的研究方法－DNA芯片技术73转录组分析策略7475二、蛋白质组学（Proteomics）

蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指proteinsexpressedbyagenome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组定义：广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质；狭义上,可以指不同时期细胞内蛋白质的变化。蛋白质组学定义：研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学。蛋白质组学的研究内容：分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量；确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等。76

研究基础（1）生物学的发展，特别是基因组测序的完成为我们提供了蛋白质组数据库；（2）生物质谱和分离科学的进步为我们提供了分离和鉴定的必须手段；（3）计算机技术的提高，特别是生物信息学的发展为我们储存和处理海量数据提供了有力的支持。77蛋白质组研究更为复杂和困难：

蛋白质数目大大超过基因数目。

蛋白质随时间和空间而变化。

78蛋白质组研究的技术特点和要求高分辨率高灵敏度高通量自动化规模化79蛋白质组研究的基本技术和仪器分离Gel-basedLiquid-basedHPLCFFESCX,RP,SECSDS,IEF2DE鉴定MSMALDI-TOF-MSESI-MSMS-MS2D-HPLCMALDI-TOF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MSGel-based/Liquid-based-MALDI/ESI-MS-MS计算机技术80蛋白质组学实验室所需条件示意81毛细管高效液相色谱仪（美国戴安公司）824700/4800ProteomicsAnalyzer

(美国ABI公司）83CalLC-ESIQ-TOFMS(美国Waters公司)84

NanoLCLTQFTICRMS(美国ThermoFINNIGAN公司)85双向电泳蛋白质组示意86蛋白水解，质谱分析87

生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离感兴趣蛋白点的切取图像扫描和初步分析蛋白信息的初步获得胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证882DE蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定89蛋白质2D电泳分析902-DE技术的缺点

极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。

胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。

91实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）肽混合物质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS）选择肽段裂解（PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS）计算方法蛋白质序列数据库（＋核酸序列翻译数据库）肽质量检索未解析碎片离子检索酶切质谱鉴定蛋白质的策略92蛋白质组学研究方法分类（1）蛋白质定性分析（2）蛋白质组相对定量分析方法①直接进行比较，包括SDS、2DE、HPLC；②标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICAT）、等量标签相对和绝对定量方法（iTRAQ）、元素标记亲和标签（ECAT）、DIGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记（SILAC）。③酶促同位素标记法，如18O标记。93优势：荧光试剂灵敏度可达到100pg-ng；动态范围高达4-5个数量级；可同时显示所有差异蛋白；同一块胶内可比较三个不同的样品；内标的使用可进一步克服双向凝胶电泳发展至今的一个瓶颈——重现性的问题：包括胶-胶以及操作者-操作者的重现性；通过统计分析，可以更加准确地进行蛋白质组差异分析，减少系统误差，从而使实验结果能准确反映生理病理过程中的差异问题。

2D-DIGE技术的实验流程双向电泳不同波长扫描得到三个样品的图像DeCyder软件图像分析找出差异蛋白标记好的样品等量混合Cy3Cy2Cy5标记疾病2Cy2标记内标（各实验组等量混合）Cy3标记正常1Cy594（3）蛋白质组绝对定量分析方法①基于外标或内标法进行蛋白质绝对定量；②基于凝胶电泳进行蛋白质绝对定量方法；③无标记（labelfree）定量模型如：基于蛋白质的量与其被质谱鉴定到的肽段数正相关；基于spectralcount的蛋白质组定量模型；基于不同归一化指标与蛋白质浓度的关系；基于蛋白质被质谱检测的spectralcounts和肽段鉴定概率；基于理论肽段占总肽段的分数近似等于实际测定的MSMS扫描次数占总扫描次数的分数。95一些研究热点在疾病蛋白质组领域提交的论文摘要中，约有一半在做biomarker；在疾病蛋白质组领域提交的论文摘要中，约有一半在做癌症研究。96ICAT、iTRAQ寻找HCC组织biomarkerSERPA（serologicalimmunoscreeningoftumourantigens）：利用HCC病人自身免疫产生的抗体筛选biomarker，这个想法很不错。DIGE研究butyrate治疗HCC97每年有5000多篇关于biomarker的报道，但很少有应用于临床的；寻找biomarker不应只局限于一种技术，从单一技术获得的信息并不足以令人相信。98蛋白折叠等二级、三级结构信息，以及修饰等信息也与癌症等紧密相关，也会影响biomarker的寻找，应有相关研究，但目前尚无。寻找biomarker的主要困难：技术单一样品复杂99肺癌biomarker寻找胃癌biomarker寻找这两个实验都找到了由于各自癌症引发变化的蛋白，但并不是肺癌或胃癌特异的biomarker。100蛋白质组技术开启了biomarker的寻找；但仍处于起步阶段，技术发展至关重要，比如蛋白分离、鉴定蛋白的定量。101蛋白质数据库11.PIR和PSDPIR国际蛋白质序列数据库(PSD)是由蛋白质信息资源(PIR)、慕尼黑蛋白质序列信息中心(MIPS)和日本国际蛋白质序列数据库(JIPID)共同维护的国际上最大的公共蛋白质序列数据库。PIR和PSD的网址是：/。2.SWISS-PROTSWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库，由欧洲生物信息学研究所(EBI)维护。SWISS-PROT的网址是：http://www.ebi.ac.uk/swissprot/。1023.PROSITEPROSITE数据库收集了生物学有显著意义的蛋白质位点和序列模式，并能根据这些位点和模式快速和可靠地鉴别一个未知功能的蛋白质序列应该属于哪一个蛋白质家族。PROSITE的网址是：http://www.expasy.ch/prosite/。4.PDB蛋白质数据仓库(PDB)是国际上唯一的生物大分子结构数据档案库，由美国Brookhaven国家实验室建立。RCSB的PDB数据库网址是：/pdb/。蛋白质数据库2103MarineBiotechnology,2008,10:527-537.105NAFLD蛋白质组学研究－差异蛋白鉴定比较差异蛋白上调蛋白下调蛋白M2/C21162987M5/C51436281M8/C8355150205鉴定的总体差异蛋白DIGE制备胶106NAFLD蛋白质组学研究－数据分析及验证1.GOfact分析－生物学过程2.Cluster分析3.

IngenuityPathway分析

－分子相互作用网络CD8wMCDCD5wMCDCD2wMCDPPARαGAPDHBHMTASS2周明显上调的分子：1.结合还原性谷胱甘肽：如GSTP1;2.细胞内长链脂肪酸的转运：如FABP,ACTG;3.抑制丝氨酸蛋白酶：如PRDX1。

2周明显下调的分子1.主要参与氨基酸的生物合成：如ASSY；2.二氧化碳的可逆水合：如CA3;3.保护细胞免受毒性损伤：如CATA;4.调节腺苷蛋氨酸和蛋氨酸：如GNMT。2周分子网络-主要参与

1.代谢性疾病2.分子转运107三、代谢组代谢组（metabolome）是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。

代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。108代谢组学概念的提出1999年,ImperialCollege的Nicholson等人基于近20年的研究，提出了代谢组学的概念109The“Omics”Cascade

Metabolomics:

what’shappeningdownstreamofDNA?转录组学、蛋白质组学等可同时检测大量基因或蛋白质的表达变化情况，但这些变化不能与生物学功能的变化建立直接联系。

代谢组学方法则可为代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。110代谢组学的特点任何外源性物质、病理生理变化或遗传变异的作用都会反映到各种生物学途径上，对机体新陈代谢的稳态平衡产生干扰，从而使内源性代谢产物中各种物质的浓度和比例发生变化。代谢组是细胞内各种生物学过程的终产物，是反映各种生命活动状态的信号放大器，如遗传变异、疾病、药物、饮食和环境因素影响等。代谢组学研究机体在某一时刻所有代谢物的集合，反映了机体所处的环境，这又与机体的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。111代谢组学可以研究代谢产物谱的动态变化过程，可以反映出生物学过程的发生、发展和结果的全过程。每一种影响因素都会在生物体中产生特征的内源代谢谱模式，这种特征包含了生物效应的机理和作用位点的信息。生物体液或组织中代谢物组成和水平的变化直接反映了生物体对这些影响因素的综合应答，能够展示形态学和传统生化指标不能区分的表型。代谢组学的特点112代谢组研究的层次代谢物靶标分析：某个或某几个特定组分的分析代谢轮廓分析：少数预设的一些代谢产物的定量分析代谢组学：限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量代谢物指纹分析：不分离鉴定具体单一组分,而是对样品进行快速分类(如表型的快速鉴定)113114代谢组学的研究样品体液尿液血浆（血清）脑脊液前列腺液唾液细胞细胞提取液组织完整组织组织提取液115代谢组学研究工具NMRMS-hyphenatedLC-MS（Q,IT,TOF）GC-TOF/MSFT-ICR-MS

HPLCCEFT-IR116生物体液色谱-质谱联用分析高分辨液体NMR分析不挥发性组分高分辨魔角旋转NMR分析挥发性组分组织样本衍生化GC-TOF/MS去卷积、峰识别、峰对齐、归一化数据库查询代谢指纹谱代谢物指认多元统计分析特征代谢物谱图数据处理代谢指纹谱文献、数据库查询多元统计分析特征代谢物代谢物指认毒性、药理作用、疾病相关代谢标志物代谢组学数据库动物实验或临床样本采集不同色谱柱LC-ESI/APCI-MS提取液代谢组学分析技术路线图组织病理学观察生化分析117(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)基于NMR技术的代谢组学分析流程样本采集谱图采集模式识别生物标志物数字化处理数据库建立模型预测动物实验118样品提取样品预处理化合物分离数据分析可视化建立模型固相微萃取固相萃取亲和色谱气相色谱液相色谱法毛细管电泳光谱质谱核磁共振电化学生物信息学化学信息学计算生物学检测及鉴定自动进样体液组织等基于色谱-质谱技术的代谢组学分析流程119NMR研究代谢组学的特点优点无损伤性样品前处理简单能够检测到在检测限内的所有有机化合物谱峰强度能够反映出化合物的相对含量缺点灵敏度低,解决方法：超低温探头，灵敏度提高4倍，可检测到ug级

CapNMR，

10，~10ng120代谢组学研究应用领域代谢组学的应用范围包括生命科学的主要领域及与人类活动密切相关的领域：

a．创新药物的研发中的药物安全性和药效评价；

b．重大疾病的发病机制、早期诊断和预后；个性化治疗

c．中医药现代化（复方药理、毒理，中医证候模型等）

d．功能基因组学；

e．微生物工程、生物安全；

f．营养基因组学，个性化营养学；

g．食品安全；

h．环境毒理。121NAFLD机制和标志物的代谢组学研究122123124125126127P1=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)P2=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)P3=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)P0=11+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)128酿酒酵母对乙醇胁迫应激机制的代谢组学研究129130BABAA131ABEFCGHIJABCDEVarID(Primary)132133第七节合成生物学134合成生物学(Syntheticbiology)是在基因组学、系统生物学和生物信息学等学科的基础上，于2000年后迅速发展起来的一门新兴学科（McDaniel,2005）。合成生物学依据自下而上的策略，从最基本的要素开始逐步构建生物体的零部件直至人工生命系统（Mark,2009），其核心是按照工程学的思路来设计生物零件，例如启动子、功能基因、调控基因等，将其组装成具有一定生物学功能的基本元件，然后构建全新的生物学系统或对现有的生物体进行有目的的改造。什么是合成生物学

——不断发展的定义新的生物零件、装置和系统的设计与建造对现有的、天然的生物系统的重新设计目标：创造可预知的、可再生的、功能明确的生物“机器”有机体，服务人类社会

135136与传统基因工程的不同——特定的输入，精确而特定的输出137什么是合成生物学?传统生物学通过解剖生命体以研究其内在结构，合成生物学从最基本的要素开始将零部件组装为新的人工生命系统零件（parts）→装置(device)→系统(system)Parts:promoter、RBS、enhancer、terminatorDevices:signalinput/output,toggleswitch,oscillator,feedbackSystems:1381391.搭建框架：DNA组装、模块重排、染色体精简、人工细胞膜2.安装固定件：基因整合至染色体3.铺设管线：通道、支架蛋白4.安装可移动装置：转座子、转录因子、5.安装调控软件:锌指蛋白、核糖开关、嵌合受体140合成生物学的使命

科学发展的必然。生物、物理、化学、计算机、工程等科学发展到一定阶段产生的新学科。合成生物学被认为在化工、制药、能源、材料、环保等领域具有广阔应用前景。2004年合成生物学被美国MIT出版的《技术评论》评为“改变世界的10大新技术之一”，具有巨大的应用开发潜力,为未来生物技术经济的主要推动力。141文章大都发表在顶级刊物上142合成生物学的高端文献WangHH,IsaacsFJ,CarrPA,etal.Programmingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolution.Nature.2009;460,894-8.CullerSJ,etal.ReprogrammingCellularBehaviorwithRNAControllersResponsivetoEndogenousProteins.

Science,2010,1251-1255ToTsz-Leungetal.NoiseCanInduceBimodalityinPositiveTranscriptionalFeedbackLoopsWithoutBistability.Science,2010:1142-1145CalebJ.BashorCJ,etal.UsingEngineeredScaffoldInteractionstoReshapeMAPKinasePathwaySignalingDynamics.Science,2008:1539-1543AriE.FriedlandAE,etal.TimothyK.Lu,XiaoWang,DavidShi,GeorgeChurch,JamesJ.Collins.SyntheticGeneNetworksThatCount.Science

2009:1199-1202NguyenKT,RitzD,GuJ-Q,etal.Combinatorialbiosynthesisofnovelantibioticsrelatedtodaptomycin.Pnas,2006,103,17462-7.143LevskayaA,ChevalierAA,TaborJJ,etal.Syntheticbiology:EngineeringEscherichiacolitoseelight.Nature,2005,438,441-442GardnerTS,CantorCR,CollinsJJ.ConstructionofagenetictoggleswitchinEscherichiacoli.Nature,2000,403,339-342LartigueC,VasheeS,AlgireMA,etal.CreatingBacterialStrainsfromGenomesThatHaveBeenClonedandEngineeredinYeast.Science,2009,325,1693-1696KumaranP,StephanopoulosG.IsoprenoidpathwayoptimizationfortaxolprecursoroverproductioninEscherichiacoli.Science,2010,330(6000):70-74GibsonDG,GlassJI,LartigueC,etal.Creationofabacterialcellcontrolledbyachemicallysynthesizedgenome.

Science,2010,

329:52-56ShanaToppandJustinP.Gallivan.

GuidingBacteriawithSmallMoleculesandRNA.J.Am.Chem.Soc.,2007,129(21),6807–6811ReinkeAW,etal.ASyntheticCoiled-CoilInteractomeProvidesHeterospecificModulesforMolecularEngineering.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(17),6025–6031“基因狂人”文特尔（CraigVenter）发表了他在合成基因组方面的最新结果。首先合成了蕈状支原体的基因组。然后成功地将该基因组移植到山羊支原体中（Mycoplasmacapricolum），让新的基因组取代了宿主原有的基因组144国外研究及应用现状理论与应用研究并重发表了许多高水平文章，大多刊登在Nature,Science,Cell,Pnas,PlosBiology,JACS等顶级或一流刊物上基于新思路构建基因工程菌，着力解决产量低这一重大科学难题研发了一批重要生物基化学品，包括C3和C4平台化合物，生物能源(多元醇、多元酯)，高值医药产品等145国外研究飞速发展，已经设计了多种基因控制模块，包括开关、脉冲发生器、振荡器等，可有效调节基因表达、蛋白质功能、细胞代谢或细胞间互作。

2003年麻省理工学院成立标准生物部件登记处，供全世界科学家索取，以便在现有零部件基础上组装更复杂的生物系统。美国众议院能源和商务委员会就合成生物学举行听证会。科学家认为，合成生物学将在清洁燃料、新疫苗及药品等领域得到广泛应用。作证专家包括文特尔、加州大学伯克利分校教授杰伊·基斯林等146国外合成生物学领域的活跃分子CraigVentor测序先驱，基因狂人JayDKeasling的最初专业不是生物工程DrewEndy,最初是学建筑的TomKnight是搞计算机模拟的GeorgeM.Church人在哈佛医学院，从事的不是医学研究JamesC.Liao,从事代谢工程及合成生物学147CraigVentor基因狂人——克雷格·文特尔冲浪运动员,越战老兵,越战期间服役于美国海军，曾试图游入深海自杀，但当游了1英里后，改变了主意。文特尔仅仅是毕业于社区大学的本科生，72年获得生化本科学位，75年获得加州大学圣迭戈分校的生理和药学博士学位。CeleraGenomics创始人和前总裁，试图创建付费的基因数据库，遭到唾骂，激发了其他研究组加快完成测序并序列发布为开放获取（openaccess）148上世纪已提出“最小基因组”概念Hutchison,C.A.,Peterson,S.N.,Gill,S.R.,Cline,R.T.,White,O.,Fraser,C.M.,Smith,H.O.andCraig,V.J.(1999)Globaltransposonmutagenesisandaminimalmycoplasmagenome.Science,286,2165-2169.

利用转座子插入突变，筛选突变菌株，从而推断哪些基因是必须的，哪些基因是可有可无的149Essentialgenes

Glass,J.I.,Assad-Garcia,N.,Alperovich,N.,Yooseph,S.,Lewis,M.R.,Maruf,M.,Hutchison,C.A.,Smith,H.O.andVenter,J.C.(2006)Essentialgenesofaminimalbacterium.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103,425-430.

细胞中并非所有基因都是必须的，通过精简机构，保留维持生命的的最少基因(essentialgenes)，减轻负担，实现满负荷工作150JayDKeasling1986获得化学和生物学学士学位,91年密歇根大学化学工程学博士,斯坦福大学进行博士后。在加州大学伯克利分校，其研究突飞猛进，迅速晋升教授，领导美国第一个“合成生物学”实验室。基因改造微生物生产出青蒿素前体物——青蒿酸DKRo,JDKeasling.

Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast.Nature,2006,440(7086):940-943151JamesC.Liao的工作AtsumiS，HanaiT，LiaoJC．Non-fermentativepathwaysforsynthesisofbranched—chainhigheralcoholsasbiofuels.Nature,2008,451:86-90改造大肠杆菌生产高级醇Expandingmetabolismforbiosynthesisofnonnaturalalcohols

PNAS,

2008;105:20653-20658.非天然醇Directphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehyde.NatBiotechnol,2009,27(12):1177-80直接从发酵液中蒸馏异丁醛

ExpandingmetabolismfortotalbiosynthesisofthenonnaturalaminoacidL-homoalanine.PNAS,

2010;107:6234-6239.非天然氨基酸ProfessorinUniversityofCalifornia,LosAngeles2002年美国医学与生物工程研究院院士152国内研究现状(1)起步晚原因之一，理论与实践脱节中科院、北大、复旦、中山、中国农大等高校和科研院所“重理论，轻应用”，生物工程院校“重应用，但理论较弱”，代谢工程、合成生物学的创新思路往往受基础研究的启示

例如，麻省理工Alper的全局转录工程思路基于对RNA聚合酶的深刻认识，并与定向进化技术相耦合，因此文章发表在Science上，他引次数极高(2)突出成果不多，方兴未艾153(3)引起了国内学者的高度重视中国科学院院士张春霆教授说：“合成生物学在认识生命、揭示生命奥秘、重新设计及改造生物等方面具有重大科学意义，代表了下一代的生物技术。”元英进教授认为，我国要紧跟合成生物学科技前沿，在功能模块的合成与检测，新生命功能的设计原理，合成基因网络建模、噪音传递、可调性、稳定性分析，系统微调、进化，生物网络的解耦、抽提与网络重构，系统新功能集成与优化等方面开展研究。154重点实验室155学术委员会名单

杨胜利院士中科院上海生物工程研究中心邓子新院士上海交通大学赵国屏院士中科院上海植生生态所来鲁华教授北京大学黄力研究员中科院微生物所刘海燕教授中国科学技术大学吴家睿研究员中科院上海生科院张嗣良教授华东理工大学陈代杰研究员上海医工院王磊教授南开大学孙志浩教授江南大学李亦学研究员中科院上海生物信息技术研究中心刘文研究员中科院上海有机所姜卫红研究员中科院上海植生生态所薛红卫研究员中科院上海植生生态所1562010年国家启动了合成生物学重大项目合成生物学可谓先进生物制造157具体研究内容构建非冗余模式发酵菌种：自上而下策略up-to-bottom

精简的大肠杆菌：原核表达平台精简的酿酒酵母：真核表达平台考察指标——细胞分裂快，遗传稳定组装大宗生物基化学品的合成途径：

1,3-丙二醇、丁醇、丙烯酸、富马酸、

3-羟基丙酸、紫杉二烯、青蒿酸、白藜芦醇等高值天然产物等创制新化合物——基于组合生物合成原理，将酶基因组装后筛选，创制新能源，目前生物能源局限于脂类和醇类

158科学问题

contemplatingthesyntheticcell基因组越小就越高效吗？阈值如何如何协调多基因共表达，以便降低代谢噪音？如何构建“缓冲型坚强菌”，该菌能从容应对环境变化（摇瓶发酵→中试→放大），使其产量变化不大，即“任凭风吹雨打，我自闲庭信步”工程菌的群体遗传学问题159精简代谢网络实现基因满负荷工作重构代谢网络，优化酶基因组合合成生物学的意义加速合成生物系统工程化的进程

需要工程化、标准化的策略，将研究人员从日复一日的重复性操作中解脱出来。

验证和深化对于生物现象的理解“合成”将是“分析”的必要补充。成功固然会帮助我们建立合成生物学的基本原则和生物系统的工程化技术；失败也是人类的理解与自然生物本质间存在鸿沟的直接佐证，并会为我们如何更好的理解和运用源自于自然的技术提供指引。162合成生物学研究内容目前合成生物学研究应用主要包括两个方面，一个方面是“人造生命”，即通过设计和构建新的生物零件、组件和系统，创造自然界中尚不存在的人工生命系统。另一个方面是通过对现有的、天然存在的生物系统进行重新设计和改造，修改已存在的生物系统，使该系统增添生物传感、高效计算、环境污染监测以及药物与生物基产品的高产等新功能。163合成生物学应用BioEnergy.Cellsarebeingengineeredtoconsumeagriculturalproductsandproduceliquidfuels.BritishPetroleumandtheUSDOEgranted$650milliondollarsforresearchintheSanFranciscoBayArea.DrugProduction.Bacteriaandyeastcanbere-engineeredforthelowcostproductionofdrugs.Examplesincludetheanti-malarialdrugArtemisininandthecholesterol-loweringdrug（降胆固醇药）.Materials.Recombinantcellshavebeenconstructedthatcanbuildchemicalprecursorsfortheproductionofplasticsandtextiles,suchasBio-PDO（1，3－丙二醇）andspidersilk（蛛丝）.Medicine.Cellsarebeingprogrammedfortherapeuticpurposes.BacteriaandT-cellscanberewiredtocirculateinthebodyandidentifyandtreatdiseasedcellsandtissues.164合成生物学研究举例“合成生物学”2004年被美国MIT出版的“TechnologyReview”评为将改变世界的10大新出现的技术之一（10EmergingTechnologiesThatWillChangeYourWorld）。短短几年的实践已经证明该预见的正确性。通过使用自然界提供的简单模块，许多合成生物学研究者在进行两方面的研究：建立有用装置；研究可以取代自然生物系统的人造生物系统。这些进展主要涉及如下几方面：（a）合成振荡器和开关；（b）人造细胞－细胞相互作用系统；（c）工程化的信号转导系统；（d）代谢途径工程；（e）通过蛋白质工程制造的新型生物传感器；（f）最小细胞及合成基因组。这方面的进展已经有许多专门的综述。165（1）美国UCB化学工程系教授、劳伦斯国家实验室合成生物学中心主任Keasling本科曾获得化学与生物学双学位，后来又获得化学工程博士学位。所以在他从事代谢工程及合成生物学的研究中能很好地将化学、生物学、化学工程学相结合。

在他从事抗疟疾药的生物合成研究中，始终把细胞当作微生物制药工厂（Microbialdrugfactories），进行设计、加工、集成、组装、控制。体现在合成生物学技术上包括DNA的合成、来自细菌、酵母及植物（青蒿Artemisiaannua）等多种基因及代谢途径的组装、多基因的精密调控等。他们关于抗疟疾药物生物合成的研究成果先后发表在2003年NatureBiotechnology和2006年的Nature上。合成生物学研究举例166Keasling实验室

ResearchInterests:代谢工程，系统生物学，合成生物学SyntheticBiologyforSyntheticChemistryACSChemicalBiology,2008,3:64-76（合成生物学－合成化学－青蒿素合成举例）ImportanceofsystemsbiologyinengineeringmicrobesforbiofuelproductionCurrentOpinioninBiotechnology2008,19:228–234（系统生物学－生物燃料生产）Metabolicengineeringofmicroorganismsforbiofuelsproduction:frombugstosyntheticbiologytofuels（代谢工程：微生物－合成生物学－生物燃料）

CurrentOpinioninBiotechnology2008,19:inpress

167Theprocessforthemicrobialproductionofartemisinin.Usingsyntheticbiology用合成生物学生产抗疟疾药青蒿素168为了尽快使研究成果产业化，Keasling等人专门建立了新的公司—AmyrisBiotechnologies,用合成生物学技术进行抗疟疾药及生物能源的生产。2005年MIT“技术评论”将“细菌工厂”（BacterialFactories）作为将影响世界的新出现的10大技术之一，用大量篇幅以Keasling的工作及AmyrisBiotechnologies公司为例，对细菌工厂进行了介绍。由于在生物合成抗疟疾药物的突出成就，Keasling教授被美国“发现”杂志评选为2006年度最有影响的科学家。该项目已经获得比尔－梅林达盖茨基金会4300万美元的资助，进行进一步的实验室研究、中试、临床实验等后续工作。169170171172ChristinaDSmolke研究组最新论文ProductionofbenzylisoquinolinealkaloidsinSaccharomycescerevisiae

NatureChemicalBiology,2008,4(9):564-573Higher-OrderCellularInformationProcessingwithSyntheticRNADevices

Science,2008,322,456-460Model-guideddesignofligand-regulatedRNAiforprogrammablecontrolofgeneexpression

MolecularSystemsBiology,2008,4;No.224;173ChristinaD.SmolkeDivisionofChemistryandChemicalEngineeringCaliforniaInstituteofTechnologyFoundationaladvancesinRNAengineeringappliedtocontrolofbiosynthesis174ASyntheticGene-MetabolicOscillator

Fung,E.,Wong,W.W.,Suen,J.K.,Bulter,T.,Lee,S.G.andLiao,J.C.(2005)Nature,435,118-122.

wedesignedandconstructedasyntheticcircuitinEscherichiacoliK12,usingglycolyticfluxtogenerateoscillationthroughthesignallingmetaboliteacetylp