高三生物一轮复习课件基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序P400/归纳总结.

如何筛选出含有目的基因的受体细胞归纳总结选择限制酶的基本原则：（1）切割目的基因时：能切下目的基因且不破环目的基因；（2）切割质粒时：不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因（至少保留一个）、复制原点等；（3）保证目的基因和质粒能连接：用同种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶；

保证目的基因和质粒能正向连接：双酶切选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势？

双重筛选。标记基因AmpR可以检测质粒是否导入，LacZ基因效应可以判断导入的是空质粒还是重组质粒P400/3.

B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。注：启动子*是指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；

Luc

基因表

达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。（4）鉴定和筛选表达B基因的转基因植株的方法是

⁠

⁠。检测加入荧光素的该植物卵细胞中是否发出荧光方法1：PCR扩增技术转基因生物提取DNA/mRNA逆转录DNA作为模板PCR操作是否扩增出目的基因凝胶糖琼脂电泳操作方法②：核酸分子杂交技术原理：碱基互补配对方法②：核酸分子杂交技术原理：碱基互补配对过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带原理：抗原与抗体的特异性结合方法③：抗原—抗体杂交技术考点一

基因工程的基本工具1.基因工程的概念2.基因工程的基本工具（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）（2）DNA连接酶（3）基因进入受体细胞的载体【教材拾遗】

（选择性必修3P72旁栏思考）DNA连接酶和

DNA聚合酶不是一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个

DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有

的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为

模板，而DNA连接酶不需要模板。【思考】

限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的

DNA分子？提示：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中

不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

1.（选择性必修3P71正文）限制酶能够识别双链DNA分子中特定核

苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。

（

×

）2.（选择性必修3P71正文）限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA

分子的两条链分别切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处

切开形成的是平末端。

（

√

）×√3.（选择性必修3P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制

酶、DNA连接酶、载体。

（

×

）4.（选择性必修3P72正文）质粒上标记基因的存在，是便于重组

DNA分子的筛选。

（

√

）5.（选择性必修3P72正文）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为

筛选的标记基因。

（

×

）×√×

【探究1】

基因工程的工具酶1.图1和图2分别表示的是

Eco

RⅠ限制酶和

Sma

Ⅰ限制酶的作用示意图。

请据图回答：（1）请说出

Eco

RⅠ限制酶和

Sma

Ⅰ限制酶识别的碱基序列及切割的

位点。提示：

Eco

RⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位

点在G和A之间；

Sma

Ⅰ限制酶识别的碱基序列是—

CCCGGG—，切割位点在C和G之间。（2）

Eco

RⅠ限制酶和

Sma

Ⅰ限制酶作用的结果分别是什么？提示：

Eco

RⅠ限制酶切割DNA分子，产生黏性末端，

Sma

Ⅰ限

制酶切割DNA分子，产生平末端。（3）以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？提示：说明限制酶具有专一性。专一性指的是限制酶能识别

特定的核苷酸序列，并在特定的切割位点上进行切割。2.DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对

化学键有何影响？提示：均作用于磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶是形成磷

酸二酯键，限制酶是破坏磷酸二酯键。【探究2】

基因工程中的载体3.分析质粒载体结构模式图，回答下列问题：（1）质粒上氨苄青霉素抗性基

因的作用是什么？提示：作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。（2）为使外源基因插入质粒中，质粒需具备的条件是什么？提示：有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点。【归纳总结】1.基因工程的理论基础2.与DNA有关的几种酶的比较

1.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是

（

）A.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸

二酯键C.

E

.

coli

DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的

DNA2.（2024·江西南昌高三开学考）限制酶是基因工程中必需的工具之

一，下图表示五种限制酶的识别序列及切割位点。下列关于限制酶

的叙述，错误的是（

）限制酶识别位点

Eco

RⅠ↓

5'－GAATTC－3'3'－CTTAAG－5'

↑

Bam

HⅠ↓

5'－GGATCC－3'3'－CCTAGG－5'

↑

限制酶识别位点Sau

3AⅠ↓

5'－GATC－3'3'－CTAG－5'

↑

MfeⅠ↓

5'－CAATTG－3'3'－GTTAAC－5'

↑

Eco

RⅤ↓5'－GATATC－3'3'－CTATAG－5'

↑

A.

Eco

RⅠ和

Eco

RⅤ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和

平末端B.

Eco

RⅠ和

Mfe

Ⅰ切割产生的DNA片段能被

E

.

coli

DNA连接酶相连在

一起C.

Bam

HⅠ和

Sau

3AⅠ切割产生的DNA片段，连接后一定能被

Bam

HⅠ

切割D.以上五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列，并切开特定部

位的磷酸二酯键考点二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取（1）筛选合适的目的基因①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变

⁠

或获得

⁠等的基因。主要是

指

⁠的基因。②筛选目的基因的方法：从相关的已知

⁠清晰

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。受体

细胞性状预期表达产物编码蛋白质结构和功能（2）利用PCR获取和扩增目的基因①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、

dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为

DNA的合成提供能量。②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起

点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端

开始连接脱氧核苷酸。【教材拾遗】

（选择性必修3P77相关信息）真核细胞和细

菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液

中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基

序列互补配对的短单链核酸。（3）人工合成目的基因①逆转录法：已知目的基因的核苷酸序列，而且基因比较

小，可以以目的基因的mRNA为模板，借助

⁠酶合

成双链DNA，其过程如图：目的基因的mRNA

双链DNA（目的基因）逆转录②化学合成法：已知某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基

因序列，然后直接合成目的基因，其过程如图：2.基因表达载体的构建（1）构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中

，并且可以

⁠

⁠给下一代。②使目的基因能够

⁠和发挥作用。稳定存在遗

传表达（2）基因表达载体的组成（3）基因表达载体的构建过程【教材拾遗】

（选择性必修3P80正文）不能将目的基因插

入载体的标记基因中的原因是标记基因用于鉴定目的基因是

否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，

若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进

行筛选。3.将目的基因导入受体细胞【教材拾遗】

（选择性必修3P81资料卡）农杆菌细胞内含有Ti质

粒，当它侵染植物细胞后，能将目的基因导入受体细胞并整合到染

色体的DNA上，原因是农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染

的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。4.目的基因的检测与鉴定

1.（选择性必修3P77相关信息）引物是一小段能与DNA母链的一段

碱基序列互补配对的短单链核酸。

（

√

）2.（选择性必修3P79旁栏思考）PCR技术扩增目的基因时不必知道基

因的全部序列，该技术既可以扩增DNA又可以扩增mRNA。

（

×

）3.（选择性必修3P80正文）构建基因表达载体是基因工程的核心工

作，唯一不需要进行碱基互补配对的过程是将目的基因导入受体细

胞。

（

√

）√×√4.（选择性必修3P80旁栏思考）生物的所有DNA通过注射或花粉管

通道法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。

（

×

）5.（选择性必修3P81资料卡）Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因进入

宿主细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。

（

√

）6.（选择性必修3P82正文）应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄

植株中目的基因是否存在及其是否表达。

（

×

）×√×

【探究1】

PCR反应1.根据PCR反应过程示意图分析下列问题：（1）PCR技术为什么需要引物？提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸

DNA链。（2）利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示：目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序

列不同。（3）在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引

物之间的碱基序列的要求是什么？提示：两种引物之间不能互补配对。（4）为检测胚乳细胞中

Wx

基因是否表达，科研人员提取胚乳中的

总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总

cDNA中专一性地扩增出

Wx

基因的cDNA，原因是什么？提示：引物是依据

Wx

基因的一段已知序列设计合成的（或引

物能与

Wx

基因的cDNA特异性结合）。（5）若一个DNA分子在PCR中经过

n

轮循环，理论上需要消耗多

少个引物？第

n

轮循环需要消耗多少个引物数？提示：经过

n

轮循环需要消耗引物数为（2

n

＋1－2）个，第

n

轮循环需要消耗的引物数为2

n

个。【归纳总结】PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123

n

DNA分子数2482

n

含引物A（或

B）的DNA分子数1372

n

－1同时含引物A、

B的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22

n

－2共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22

n

＋1－22.构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的

DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是

↓—GGATCC，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是↓

—GATC，根据下图示分析回答下列问题：【探究2】

限制酶的选择（1）请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切

割后形成黏性末端的过程。提示：限制性内切核酸酶Ⅰ：（2）切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明

理由。提示：用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制

酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切

割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同

时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质

粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限

制酶Ⅰ切割质粒。【归纳总结】限制酶的选择技巧（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择

Pst

Ⅰ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择

Sma

Ⅰ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不

同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用

Pst

Ⅰ和

Eco

RⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点或切割后

有与之相同的末端）。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类（3）根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒

均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取（设切割目的基因的限制酶为

Xba

Ⅰ和

Sac

Ⅰ）。

1.（2024·山西忻州高三联考）将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐

盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增

OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为（

）A.5'—CTTGGATGAT—3'和5'—TCTGTTGAAT—3'B.5'—CTTGGATGAT—3'和5'—TAAGTTGTCT—3'C.5'—ATTCAACAGA—3'和5'—ATCATCCAAG—3'D.5'—ATTCAACAGA—3'和5'—GAACCTACTA—3'解析：

—

端为DNA链的5'-端，—OH端为DNA链的3'-端。进

行PCR时，引物与模板链的3'端结合，因此在扩增OsMYB56时需要

添加的引物是5'—CTTGGATGAT—3'和5'—TCTGTTGAAT—3'，A

项符合题意。2.B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。注：启动子*是指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；

Luc

基因表

达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。回答下列问题：（1）启动子是

⁠酶识别并结合的部位。题中的基因表

达载体除了启动子外，还必须有

⁠

（答出两点即可）。（2）为筛选出导入重组质粒的农杆菌，培养基除了添加农杆菌生

长繁殖必需的成分和琼脂外，还要添加

⁠

⁠。RNA聚合目的基因、终止子、标记

基因潮霉素和卡那霉素

（3）②过程利用了农杆菌能感染水稻愈伤组织并且将Ti质粒上

的

转移至水稻愈伤组织，并整合到水稻细胞染色

体上，这种方法称为

。除此之外，还可

用

⁠法把目的基因导入植物受体细胞中。（4）鉴定和筛选表达B基因的转基因植株的方法是

⁠

⁠。T-DNA农杆菌转化法花粉管通道检测加入荧光

素的该植物卵细胞中是否发出荧光【归纳总结】如何筛选出含有目的基因的受体细胞（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如

果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素

抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，

则四环素抗性基因失活。（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细

菌、含质粒的细菌。（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生

长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、

4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，

如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的

即含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄

青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.DNA的粗提取与鉴定（1）实验原理（2）实验步骤①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA

分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因

是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血

细胞作为材料。【思考】

DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？

为什么？提示：不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影

响最终提取的DNA量。2.DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）实验基础（2）PCR实验操作步骤（3）DNA的电泳鉴定【思考】

DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率

的因素有哪些？提示：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。

1.（选择性必修3P74正文）DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度大。

（

√

）2.（选择性必修3P74正文）可用滤纸过滤洋葱研磨液以除去其中的

杂质。

（

×

）3.（选择性必修3P84正文）在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA

分子的大小相关。

（

×

）4.（选择性必修3P85正文）进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所

需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20℃储存。

（

×

）√×××

【探究1】

DNA的粗提取与鉴定1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。提示：哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，不适合作为提取DNA的

材料。2.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产

生怎样的影响？提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的

DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定时颜色反

应不明显。3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方

向搅拌以便获得较完整的DNA分子。4.在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操

作有哪些？提示：（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微

量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。

（2）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移

液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。（3）在进行操作

时，一定要戴好一次性手套。5.如何来评价扩增的效果？提示：观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩