DB21-T 4043-2024 水产养殖用枯草芽孢杆菌培养技术规程

ICS65.150CCSB50/59DB21TechnicalregulationforproductionofBacillussubtilisforaquaculture辽宁省市场监督管理局发布IDB21/T4043—2024本文件是按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本文件主要起草人：叶博、李石磊、赵振军、董颖、王旭达、王笑月、刘桂林、刘丹妮、张乾、曹琛、高学文、刘煜珺。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号综合楼A座），联系电话文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号联系电话1DB21/T4043—2024水产养殖用枯草芽孢杆菌培养技术规程本文件规定了水产养殖用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）生产中所涉及的术语和定义、生产环境和设备要求、培养基、菌液生产技术流程、指标检测和储运的相关技术内容。本文件适用于水产养殖用枯草芽孢杆菌的生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB3097海水水质标准GB3838地表水环境质量标准GB20287农用微生物菌剂GB/T26428饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求3术语和定义GB20287、GB/T26428确立的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1枯草芽孢杆菌bacillussubtilis芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，一种需氧菌。菌体杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动。可形成内生抗逆芽孢，芽孢呈椭圆或柱形，位于菌体中央或稍偏，形成芽孢后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黄色。3.2初级菌种theprimarystrain由单菌落接种培养，并通过甘油冷冻或试管穿刺保藏的菌种。3.3一级菌种thefirstclassstrain初级菌种在固体培养基上活化后，挑取单菌落接种至试管装液体培养基中，振荡培养的菌种。3.42DB21/T4043—2024二级菌种thesecondclassstrain试管中的一级菌种，转接至三角瓶装液体培养基中，继续振荡培养的菌种。4生产环境和设备要求4.1生产环境应符合如下条件：——厂区空气质量达到GB3095中二类环境空气质量标准要求。——发酵生产用海水应符合GB3097中二类水质要求，发酵生产用淡水应符合GB3838中III类水质要求，其他用水应符合GB3838中IV类水质要求。——发酵生产场地及发酵相关设施应符合安全、环保、消防等条件要求。——发酵生产场地需配置消毒灭菌设施。菌种储藏、无菌操作设备应与生产场地相对隔离并定期消4.2生产设备采用不锈钢发酵罐或PE材质发酵桶，设备体积根据生产规模自定。5培养基5.1一般要求培养基所使用的原材料应满足菌液生产要求，具体按GB4789.28的规定执行。对于首次使用的发酵原料应通过摇瓶或小型发酵试验后再用于发酵生产。5.2种子培养基初级菌种及一级菌种使用的种子培养基中应含有易被菌种吸收利用的碳氮源，营养丰富。种子培养基见附录A中的A.1。5.3发酵培养基二级菌种发酵培养基与扩大生产培养基相同，该培养基要求在保证菌种生长性能的同时，尽量采用来源丰富、成本低廉、营养缓释的培养基原料，培养基中还应添加缓冲剂稳定pH值。发酵培养基见附录A中的A.2。5.4固体培养基用于枯草芽孢菌种分离、鉴定及活菌计数使用。固体培养基见附录A中的A.3。6生产技术流程6.1菌液生产流程具体生产流程见附录B。3DB21/T4043—20246.2菌种要求应满足如下要求：——用于发酵的枯草芽孢杆菌应明确菌种来源的相关信息。——初级菌种使用前应先检测纯度与状态，可涂布固体培养基平板检查，枯草芽孢杆菌在固体培养基上形成灰白色或微黄色，圆形或蔓延成波浪形、不规则形的菌落，其表面粗糙、不透明、边缘扩张。具体方法按GB/T26428执行。——发酵罐接种前应检测上一级菌种的纯度和浓度，不应有杂菌污染，菌液浓度应达到1.0×108cfu/mL以上。6.3灭菌方法种子培养基、发酵培养基、固体培养基、菌种培养器材、发酵罐等均需采用高压湿热灭菌，灭菌条件为115℃~121℃,0.1MPa～0.15MPa，灭菌20min～30min。灭菌后无菌操作取培养基染色镜检，无微生物说明灭菌彻底。6.4接种方法6.4.1一级菌种接种接种针经火焰灭菌,待冷却后沾取少量初级菌种，转接至装有种子培养基的三角瓶内，完成一级菌种的接种，此过程在超净工作台内完成。6.4.2二级菌种接种一级菌种转接至发酵罐时，三角瓶口和发酵罐接种口处需有火焰保护，保证无菌操作。同时发酵罐应调节进排气阀，保持罐内正压。6.5发酵罐分批发酵参数发酵参数设置如下：a)发酵罐装液量为60%～70%；b)发酵温度为35℃~37℃;c)初始搅拌转速为250rpm～300rpm；d)接种量为装液量的2%～5%；e)初始pH值7.2～7.5，发酵过程中pH值低于6.0时补加氨水（28%），维持pH值；f)发酵过程中向培养基中连续补充无菌空气，通气量为12.5L/min。空气须经0.2μm孔径的疏水性空气过滤器过滤除菌后使用；g)发酵周期为18h～36h，当枯草芽孢杆菌活菌数达到3.0×109cfu/mL时结束发酵；h)发酵过程中可流加有机硅类消泡剂，也可在配置培养基时提前加入，具体根据设备性能决定。6.6规模化扩大培养6.6.1菌种发酵用水预处理枯草芽孢杆菌发酵用水需提前经过沉淀和砂滤，再用有效氯含量为8%～10%的次氯酸钠消毒处理。每吨海水或淡水加入500mL～800mL次氯酸钠溶液，处理24小时后以适量的硫代硫酸钠中和并曝气，利用淀粉碘化钾溶液测试有无余氯。4DB21/T4043—20246.6.2菌种的扩大培养根据扩培体积称取发酵培养基，将培养基转入扩培体积20%的发酵用水中，并向水中通入蒸汽。控制水浴温度在60℃~65℃,保持30min，对培养基进行加热溶解和消杀处理。趁热将培养基转入装有扩培体积80%发酵用水的发酵容器内，待培养基混合均匀且温度降至28℃~32℃时，快速将种子液倒入其中。接种后，取略大于桶口尺寸的全新透明塑料布盖在桶口之上，四周用绳扎紧，塑料布中央穿孔，以便于通气和排气管通过。扩大培养过程，发酵参数设置如下：a)发酵容器装液量为70%～80%；b)发酵温度为28℃~32℃;c)接种量为装液量的2%～3%；d)发酵周期72h～96h；e)发酵全程利用通气管向培养基中连续补充过滤空气。6.7发酵液处理发酵后菌液可直接使用或密封包装至灭菌容器内。7指标检测7.1抽检检测每批次产品随机抽样检测，抽样率不低于10%，检测指标包括感官、有效活菌数、杂菌率等，检验合格后方可出厂使用。7.2感官检测通过目测、鼻嗅方式对枯草芽孢杆菌发酵液进行检测。发酵结束后菌液为黄色或黄褐色的悬浊液，有明显发酵气味，存放过程中可能会出现沉淀。每批次产品会因培养基原料不同，在颜色和气味上略有差异。7.3有效活菌数测定步骤如下：——将枯草芽孢杆菌发酵液用无菌的0.85%生理盐水做10倍梯度连续稀释。——选取3个连续适宜稀释倍数的菌液，用无菌移液管取100μL接种于固体培养基上，用灭菌后的玻璃珠或涂布棒均匀涂布于培养基表面，每个稀释样品做3次重复。涂布好的平皿翻转后置于37℃培养箱中培养24h～48h。——培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板进行计数，可得到发酵液中枯草芽孢杆菌的菌量。具体平板计数方法按GB/T26428执行。7.4杂菌率测定从测定有效活菌数的稀释样品中，选取3个连续适宜稀释倍数的样本，进行枯草芽孢杆菌发酵液中杂菌数量的测定。具体方法按GB20287执行。8储运5DB21/T4043—2024检验合格的产品应储存于通风、干燥、清洁的仓库。仓库内无有害气体、易燃易爆危险品及腐蚀性化学品，远离热源。长途运输时，防止日晒、雨淋，避免长期受压和机械损伤。产品应尽快使用。6DB21/T4043—2024（资料性）发酵生产用培养基A.1种子培养