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DB14DB14/T1177—2016大田转基因棉花外源序列PCR检测规程2016-03-30发布2016-05-30实施山西省质量技术监督局发布I 1 1 1 2 2 4 4 5 5 6 7前□□言1大田转基因棉花外源序列PCR检测规程本标准规定了大田转基因棉花外源序列PCR检测的术语和定义、试剂仪器材料、样品DNA提取、NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T2162棉花抗棉铃虫性鉴定方法2内标基因Sad1Stearoyl-acylcarrierproteindesaturas利用核苷酸扩增仪通过一个包括DNA序列变性、退火引物与模板链结合、目标序列延伸的不断循环的过称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于803称取69.36g葡萄糖于1L烧杯，加500mL纯净水，充分溶解后，加入100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，10mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，200mL10%聚乙烯基乙醇，充分混匀，用纯净水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃条件下，灭菌15min，常温储存备称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH值至8.0，用纯称取18.61g乙二胺四乙酸二钠溶解于800mL纯净水中，用NaOH调节pH值至8.0，用纯净水定容至称取81.8g氯化钠于1L烧杯，加300mL纯净水，充分溶解后，加入1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸取植株嫩叶0.1g～0.2g，加入预冷的新鲜配制的提4加入24:1的氯仿∶异戊醇混合液400μL，缓慢翻转30次以上，泛白即可，8000rpm离min，将上清液转入1.5mL的干净离心管中，加0.(pH8.0，500mmol/L)，用冰乙酸调至pH8.6.2NPTII基因的检测NPTII基因为抗抗卡纳霉素基因。引物见附录A。抗虫基因检测是对编码Bt蛋白的外源cry1Ac基因或cry1Ab基因,或者是由cry1Ac和cry1Ab融合的基包括CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV35S终止子等植物转化5配制0.8%～1%琼脂糖凝胶。称取0.8电泳结束后，取出凝胶，在凝胶成像仪中观测。根据DNA分子量标准估计扩增条带大小，将电泳结果拍照形成电子文件存档。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目标DNA片段，可通过凝胶与引物扩增目标大小不一致，表明不能检测到目应详细记录植株名称、田间检测、DNA检测、凝胶电泳等检测结果，并建立档案。检测记录格式6 ’NptIINpt-F685’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’Npt-R356Bt基因CaMV反向引物35S-R1FMV5’-AGGACAGCTCTTTTCCACGTT-3’NOS5’-GCCGTTTTACGTTTGGAACTG-3’NOS5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’CaMV

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