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文档简介
艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹生物技术进展生物技术进展2024年第14卷第1期94~101CurrentBiotechnologyISSN2095‑2341SpecialForumonDevelopmentand艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹生物检测试剂保藏技术研究进展刘莹莹,赵可心,王艺霏,路凯旋,胡孔新*中国检验检疫科学研究院,北京100176摘要:生物检测试剂的扩增性能,尤其是酶试剂的生物活性对荧光定量PCR等的检测结果起决定性作用。采用不同的保藏技术对维持检测试剂的生物活性,实现生物检测试剂室温条件下长时间稳定保藏与非冷链运输,保证检测结果的稳定性、准确性、特异性和灵敏度等至关重要。针对低温保藏技术、真空冷冻干燥技术、喷雾干燥技术以及玻璃化冷冻技术4种不同保藏技术的研究进展进行了综述,在应用中总结优缺点,以期对后续相关工作的开展提供一定的科学依据。LIUYingying,ZHAOKexin,WANGYifei,LUKaixuan,HUKongxin*现了核酸的体外扩增[1-2解决了许多分子生物学研究的难题,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展,成为分子生物学与医学的支撑技术。1992年,日本科学家Higuchi将荧光染料实时监测核酸含量变化,发展出了定量PCR3]。专门针对特定靶序列设计的荧光探针可以通过特异性杂交信号检测PCR产物,提高了靶核酸检测的特异性[4-6]使得qPCR被广泛应用并成为实验室核酸检测的常规技术。当时PCR所用的DNA聚合酶不耐高温,每次温度循环后都面临聚合酶失活需要重新补充的问题。核酸检测试剂盒中酶的性能对检测效果有决定性作用,生物检测试剂生产和保藏条件不当导致DNA聚合酶或者逆转录酶失活、引物探针溶解后降解等问题导致实验成功率低。因此,维持生物检测试剂的活性使其便于保藏与运输对检测结果的成功与否至关重要,这仍然是科研人员亟待解决的难题。然而核酸检测技术发展至今,其在分子生物学实验室及以外诸多场景的使用仍然基金项目:国家重点研发计划项目(2021YFC2600503北京市科技计划项目(Z221100005222007)。刘莹莹,等:生物检测试剂保藏技术研究进展95受限于以液态形式存储的生物检测试剂。近年来,随着临床医学及生物诊断试剂的发展,研究人员探索了多个科学领域开发了一系列利于生物检测试剂保藏的技术。本文将对生物检测试剂目前常用的保藏技术,如低温保藏技术、真空冷冻干燥技术、喷雾干燥技术和玻璃化冷冻技术进行综述,以期为后续开展相关工作提供科学指导。1低温保藏技术DNA聚合酶、逆转录酶、Mg2+等。一般合成的引物为干粉,DNA从有机溶剂中干燥出来,无菌、无核酸酶,可以室温或−20℃密闭长期保存,而溶解后的DNA应保存在−20℃。TaqMan探针需避光保存,避免荧光基团降解,干粉可在−80℃保存一年以上,稀释成液体后可保存在−20℃,应防止反复冻融。dNTP由dATP、dCTP、dGTP和dTTP4个基本核苷酸组成,是新DNA链的组成元件及PCR反应必需的组分,在常见的PCR应用中,各种dNTP的常用终浓度通常为0.2mmol·L−1,一般在−20℃保存。DNA聚合酶、逆转录酶等酶制剂均为催化特定反应的蛋白质,具有生物活性,属于生物热敏性物质,高温条件下容易失活,一般−20℃保存。在应用过程中酶有液体和固体两种形式,其中液体酶制剂稳定性较差,保藏周期短,其活性受金属离子浓度、pH、温度等影响。酶促反应发生时随着反应体系温度的升高,底物分子的热运动加快,分子碰撞的机会增加,会提高酶促反应速率;但当温度升高达到一定临界值时,温度的升高可使酶变性,导致酶促反应速率下降。一般科学研究常用的商品化生物检测试剂盒放置在−20℃可保藏1年左右,且大部分试剂盒注明了反复冻融次数。生物检测试剂中的生物活性物质包括逆转录酶、DNA聚合酶等必须依赖低温冰箱进行保藏。杨镇州等[7]的实验结果表明酶的储存温度为−20℃,可以保存6个月以上,在37℃保藏条件下,随着时间的延长酶活性不断下降。生物检测试剂中的酶等试剂经过较长时间的高温运输或者暴露于较高温环境下,均有可能导致实验结果出现假阴性等不良后果,或者实验操作人员在保藏试剂过程中将其反复冻融也会导致较大实验误差[8]。因此,需保证试剂低温保藏运输以保证酶的活性。2真空冷冻干燥技术鉴于低温保藏在运输与操作方面的不便性,常温保藏的方法应运而生。想要维持qPCR等生物检测试剂在常温保藏和运输中的生物活性,则需要去除其中的水分,以减少生物检测试剂各反应组分在保藏过程中可能发生的一系列物理、化学变性和降解反应等[9-10]。目前,有2种方式可以将生物检测试剂中的水分去除,一种是针对一般非生物活性试剂的干燥处理,多采用加热的方式使液态水汽化成水蒸气而去除[11]然而加热过程可能导致生物检测试剂中的一些生物活性物质失活;另一种是真空冷冻干燥技术(以下简称“冻干”它将液态的生物检测试剂先冷冻,进而将生物检测试剂置于密闭环境中,在近真空条件下将液态水升华成气态水而去除[12]。对于真空冷冻干燥技术而言,首先,需要将生物检测试剂进行预冻处理,如放置在低温冰箱,使溶液中的自由水预先冷冻到固态[13]其次是升华干燥,在真空条件下将生物检测试剂中的固态水通过升华去除,是冻干过程中水分去除的主要阶段,升华干燥速率会通过影响水蒸气逸出的快慢进而影响生物检测试剂的内部结构[14升华干燥完成后仍然会存在10%左右的水分残留,残留水分中包括自由水和结合水[15]最后是解析干燥,在真空条件下通过解析去除升华干燥未能去除的水分,而结合水的解析干燥需要较高的能量和推动力,本阶段设置的温度在不影响试剂的情况下需尽可能高,真空度尽可能低,解析完成后试剂中可能仍存在1%左右的残留水分[16]。真空冷冻干燥方式由于整个过程均在低温下进行,最大程度地降低了对酶等热敏性生物活性物质的损害,因此应用范围十分广泛。张建中[17]利用真空冷冻干燥技术将核酸检测试剂中的引物、探针、酶试剂、dNTPs和缓冲液预混装进行冷冻干燥处理,研究表明冻干检测试剂在20℃密封保藏条件下,其检测性能与未冻干液态检测试剂无明显差异。侯月娥等[18]为了提高草量RT-PCR试剂耐保存且便于运输等性能,将配96生物技术进展CurrentBiotechnology961h的冷冻程序,优化试剂配制方案后成功研制出了全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法冻干检测试杆菌核酸检测试剂预混液进行了冷冻干燥处理,发现经过1年的4℃或20℃保存,或者3个月的37℃保存后,试剂仍然能够保持较高的活性。同样地,Tomlinson等[20]通过对橡树猝死病核酸检测试剂进行冷冻干燥处理,实现了该病菌的田间快速检测,并证实在室温下保存20周后,冻干试剂的活性仍然能够保持较高水平。Takekawa团队利用美国Idaho科技公司的核酸检测冻干试剂,成功实现了在偏远地区对野生鸟类禽流感病毒进行现场快速检测的目标,并建立了一种方便可靠的野外禽流感预警监测方法[21-22]。上述核酸扩增试剂的常温保存方式均采用了真空冷冻干燥技术,显示出该方法适用于对热敏性生物活性物质进行脱水处理的优点。目前,真空冷冻干燥技术在生物制药方面也同时,在疫苗研发与生产中也发挥了重要作用。郑波等成功制备了稳定一致的冷凝疫苗;韦晓玲等[25]通过重组慢病毒载体冻干,成功制备了无需冷冻保病毒冻干粉末疫苗能够实现与市面上的人乳头状瘤病毒疫苗Cervarix®相同的免疫原性,实现了该疫苗的常温储存和运输。真空冷冻干燥技术优势在于可使生物检测试剂等产品的质量稳定,精确控制低加工温度可最大限度地降低产品固有特性的风险,例如共晶熔化或超过玻璃化转变温度,从而使冻干试剂加工成较高质量的产品。然而,真空冷冻干燥技术也存在一些不足之处,比如生物检测试剂冻干过程中扩增性能下降,冻干试剂的失活主要是酶试剂在冻干过程中失活导致的,需要添加海藻糖、蔗糖或葡聚糖等冻干保护剂来维持其生物活性,保护剂的筛选与验证对于冻干试剂的检测性能也至关重要;其次,试剂脱水后只会残留较少的有效物质,呈粉末状,转移困难,因此冻干过程中可能还会适当添加赋形剂,包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或山梨醇等,然而赋形剂对预混装试剂检测性能的影响需进一步验证。3喷雾干燥技术喷雾干燥技术的原理是通过雾化器的雾化作用,将液体分散为细小的颗粒,雾滴在干燥的热介质空间中蒸发水分从而得到干粉物质,大致可分为3个步骤:①雾化,主要用雾化器雾化液料形成微小雾滴;②干燥,雾滴与热空气直接接触迅速蒸常用的雾化器一般分为压力式喷雾器、气流式喷雾器、离心式喷雾器等类型。喷雾干燥技术的主要特点[28-29]包括以下几个方面。①雾化后,雾滴体积显著增大,雾滴与高温空气接触的瞬间可达到90%~95%以上的水分蒸发。根据设备差异,干响。②适用于热敏性物料的干燥方法为:在进行喷雾干燥时,对于热敏感性物料来说,需要特别注意物料的处理方式。物料与热空气直接接触,但多数热量用于蒸发水分,物料温度不会超过高温空气湿球温度,也不会受高温空气的影响,无损质量品质。③应用于从高级合成物到化学品的生~产。采用喷雾干燥技术,应用于料液固含量在0~60%含固物料的干燥过程,并可以通过调整工艺分散性、多态性以及流动性等精准特性的高质量粉末。目前,生化医疗领域产品加工行业常用的真空冷冻干燥法会导致生物材料孔层塌陷,从而影响其理化结构。而喷雾干燥法可避免物料孔层塌陷,但现有的喷雾干燥技术的干燥温度对生物检测试剂活性会造成影响,高温喷雾法及亚高温喷雾法温度均大于60℃,常温喷雾法进口温度为0~60℃[30]。由于常温喷雾法存在干燥动力小除湿难度大的问题,喷雾干燥技术在生物检测试剂保藏方面可结合冷冻干燥,从而降低干燥试剂所消不同领域近年来还出现了节能喷雾、冷冻喷雾、纳米喷雾和过热蒸汽喷雾等新型喷雾干燥技术。其是近年发展起来的微粉化新技术,实现了真空冷冻干燥技术和喷雾干燥技术的结合,发展成为适刘莹莹,等:生物检测试剂保藏技术研究进展97用于蛋白质和肽类等性质不稳定成分的微粉化技活性高的粉末产品,在食品、医药等领域有广泛的应用。Zhang等[31]利用喷雾冷冻干燥技术生产全脂奶粉,有效地缩短了干燥时间,获得了高孔结构的奶粉粉体。车馨子等[32]使用喷雾冷冻干燥技术获得了粒径集中分布在117.13~200.06μm的鱼油微胶囊颗粒,将其与传统喷雾干燥制备的鱼油微胶囊产品对比,发现喷雾冷冻干燥技术制备的鱼油微胶囊质量更优。喷雾冷冻干燥技术在医药领域经常被应用于药物研究33]。Poursina等[34]利用喷雾冷冻干燥技术研制出了用于治疗骨质疏松症的激素类药物——鲑鱼降钙素。肖安风等[35]利用喷雾干燥技术优化的工艺制备柚苷酶固体酶制剂,所得酶4700U·g−1,酶活总回收率为28.3%;酶制剂含水量6.5%。张琪等[36]利用喷雾干燥技术制备固态植酸酶制剂,结果发现植酸酶的酶活回收率可达80%。喷雾干燥技术是酶制剂干燥领域应用最广泛的技术之一[37]。采用喷雾冷冻干燥技术可生产出生物活性高、可溶性好、粒径可控的诸多产品,因此其在医药领域有广泛的应用。但喷雾干燥技术也存在一些不足之处,主要包括能耗易粘壁等。后续可开展该技术对DNA聚合酶和逆转录酶生物活性影响的研究,为生物检测试剂保藏提供思路。4玻璃化冷冻技术目前对于一些生物制品,例如疫苗、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及生物酶等试剂,多以溶液形式生产,然而这些试剂在常温条件下极易发生蛋白质的快速降解导致其生物活性大大降低。真空冷冻干燥技术的冻干过程中试剂需承受各种各样的应力,这些应力常常直接或间接导致蛋白质活性不稳定[38]。玻璃化冷冻技术中的玻璃化是指在一定的降温速率下液态物质直接转变为玻璃化固体状态的过程,期间没有晶体结构的生成,也能够保持液相时期的分子以及离子的分布,在冷冻和解冻的过程中也不会在液态和晶体之间来回变化,这时所表现出的力学性质与玻璃相似,故称这种状态为玻璃态,是一种介于液态与固态之间的状态。发生玻璃化转变时所对应的温度称之为玻保持制品的玻璃态需储存在低于或等于该物质的Tg,若制品的Tg高于室温,则有希望实现室温下较长时间的稳定保存。一种将物质转变成玻璃样无定形体的技术。1985这引起了人们对该技术的极大兴趣。在蛋白质的生物药物领域,利用玻璃化冷冻技术延长药品的贮存时间,达到了非冷链条件下稳定保藏的目的。Levine[41]应用玻璃化冷冻技术,加入海藻糖等保护剂生产的疫苗能够在极端温度下保藏。胶等,利用玻璃化冷冻技术成功研制出了热稳定的减毒活沙门氏菌Ty21a细菌疫苗,该疫苗在37℃条件下能够稳定储存约12周。该技术不仅提高了活Ty21a疫苗的温度稳定性,而且增强了产品的免疫原性,有效延长了疫苗的保质期,实现了常温条件疫苗的储存和运输,为不发达地区使用疫苗提供了极大地便利。此外,生物检测试剂中的生物酶一般是与甘油按照一定比例混合后在低温条件下保藏,应用玻璃化冷冻技术也可改善酶试剂的试剂成功研制了玻璃化的限制性内切酶,该酶可在室温或37℃条件下稳定保藏4个月;并且成功研制了克隆小鼠白血病病毒逆转录酶与Klenow酶,可在室温条件下保藏,并在30s内复溶于水,证制品在室温下的稳定性。Tonnis等[35]利用玻璃化冷冻技术,以海藻糖作为保护剂,研制的乳酸盐脱氢酶可在60℃条件下稳定保藏4周。玻璃化冷冻技术在玻璃化期间也需要添加海藻糖等冻干保护剂以防止酶结构的剧烈变化,维持生物制品的高活性,延长其稳定的保藏时间,降低了冷链保藏及运输条件下产生的经济成本。该技术目前在细胞与胚胎、组织和器官中的应用也较多。例如,Zhao等[44]利用玻璃化冷冻技术对人体大型卵巢组织进行玻璃化冷冻,对处理后的组织进行形态学分析、凋亡检测以及使用免疫组织化学方法来检测解冻后的卵泡活性,结果发现玻璃化组与程98生物技术进展CurrentBiotechnology98序冷冻组两组加工工艺处理条件下,解冻后原始卵泡比例与正常形态比较无统计学差异,两组卵泡凋亡率无差异,且玻璃化组间质细胞凋亡率低于程序冷冻组。玻璃化冷冻技术具有操作步骤简毒性的保护剂浓度和较高降温速度的前提下优化玻璃化制品的Tg,即可实现制品的常温储存,这对于玻璃化冷冻技术的进一步发展和应用具有重要意义。目前,大部分生物检测试剂仍需依赖专门的交通落后地区的运输难以实现空运。若遇上重大紧急疫情爆发,极有可能会因为冷链运输资源紧张、运输费时或疫区交通不便而导致试剂供应不学领域对生物检测试剂、细胞或组织等的保藏中仍发挥着重要的作用(4种不同技术比较详见表1)。因此,选择一套合适的保藏技术手段,对于试剂的运输、维持活性物质的生物活性,保证检测质量及稳定性具有重要意义。表14种不同技术在生物检测试剂应用研究中的对比保藏技术类型应用场景优点缺点低温保藏技术和保藏、日常生活等领域有效保持核酸检测试剂的活性,延长保藏期限,同时能够确保试剂在运输和使用过程中的稳定性需要使用专业的冷藏设备,如果设备故障或保存不当,可能导致试剂失效,且冷链物流运输成本高昂真空冷冻干燥技术生物制药、疫苗研发与生可实现常温保藏与运输,同时能够保持试剂的稳定性和活性,技术成熟稳定操作时间长、设备相对较昂贵、运行成本较高,技术操作复杂喷雾干燥技术可实现常温保藏与运输,产品密度高、可溶性好且粒径可控操作时间相对较短、过程较复杂、投资成本高玻璃化冷冻技术可实现常温保藏与运输,储存稳定操作较复杂、投资成本较高5展望随着分子生物学检测技术应用越来越广泛,试剂保藏问题备受关注,真空冷冻干燥技术、喷雾冷冻干燥技术和玻璃化冷冻技术等试剂保藏技术应运而生,实现了生物检测试剂的常温稳定保存,解决了生物检测试剂低温储存和运输的限制。冷冻干燥过程中冷冻阶段、干燥阶段以及冻干后的试剂保藏过程相对复杂。其中,冷冻阶段冰-水界面形成、速冻等均可能会导致蛋白质变性/降解反应增加[45-47]不可避免地会对生物检测试剂中部分生物活性物质造成损伤[48]。此外,干燥阶段可能会导致酶等蛋白质周围水分去除后天然构象发生变化,进而影响其生物活性。生物检测试剂中的DNA聚合酶可耐高温,具有高度热稳定性,而冻干后稳定性较易维持;逆转录酶不耐受高温、稳定性较差[49-50冻干后维持长期保藏的难度较大。此外,生物检测试剂中的引物、探针为寡核苷酸片段,保藏不当会导致其降解。目前,引物/探针冻干粉形式的生产工艺已相对成熟,广泛应用于实验室科研和临床诊断中,大部分商品化的核酸提取试剂盒(磁珠法)中也使用了可常温保藏冻干粉形式的蛋白酶K,避免了酶在长时间的高温运输或者由于操作/保藏不当暴露于较高温度环境下可能造成实验结果出现假阴性等不良后果。商品化的DNA聚合酶/逆转录酶一般需要添加甘油后在−20℃低温保藏,运输过程依赖冷链运输。目前,核酸检测试剂多数为酶混合液与核酸扩增反应液分开包装,部分商品化试剂盒以一管式预混液,均以液体形式存在,无法实现常温保藏及运输。而且低温−20℃保藏条件下除酶以外多为冷冻固态,实验过程中需解冻,但试剂的配制较为复杂繁琐,实验人员操作不当极易引起试剂漏加、交叉污染等情况,因此正规的核酸检测实验室会设置分区由专业人员进行实验操作。此外,刘莹莹,等:生物检测试剂保藏技术研究进展99各反应组分尤其是引物、探针和酶用量较少,对移液器的精准度要求高[51]且试剂配制完成后需将其混匀或借助离心机回收吸附在管壁上的液体。目前,尽管有一些商品化的生物检测试剂以混合操作,但是这种储存方式并不是每个反应组分的最佳储存环境,其性能和稳定性也会受到一定程可能会因失去甘油的保护而变性失活或降解。引物和探针可能会因稀释而导致在储存过程中降解装”中包含了除了核酸模板以外qPCR所需的全部成分,可能会引起无模板情况下的非特异性扩增反应。为了最大程度地维持酶的生物活性,备选的方法是将PCR试剂与酶分开储存,使用“半预混装”的方式。除了酶以外的PCR试剂并不能在最优的条件下保存,因此它们的活性仍然受到一定程度的影响。在操作过程中,虽然试剂添加步骤相对减少,但操作者仍然需要将酶与“半预混还是需要依赖精确的移液器进行操作。同时,混检测试剂的保藏技术大部分为低温储藏,低温保藏条件下,液态生物检测试剂实验过程中需要考虑人员的专业性和严谨性,且操作步骤较为复杂,一定程度上限制了核酸检测技术的发展以及在非实验室检测环境开展检测活动。如果要解决上述问题,我们需要寻找一种方下长期保存,并且不影响其原有的活性。例如真空冷冻干燥技术较多应用于生物检测试剂保藏,在冻干之前,试剂会被预先混合,并精确地分装成单次所需用量,去除水分以减少对活性的影响,常温下仍然能够维持其原有活性。操作过程中,实验人员只需加入适量的无酶无菌水对其进行复溶即可,无需特殊的仪器操作,降低了对人员专业素质和设备的要求,推动了新一代保藏技术的发展,为后续生物检测试剂实现长时间常温保藏提供了可能。[1]SAIKIRK,SCHARFS,FALOONAF,etal..Enzymaticam‑[2]SAIKIRK,GELFANDDH,STOFFELS,etal..Primer-di‑[3]HIGUCHIR,DOLLINGERG,WALSHPS,etal..Simultane‑[4]HOLLANDPM,ABRAMSONRD,WATSONR,etal..Detec‑7280.[5]GIBSONUE,HEIDCA,WILLIAMSPM.Anovelmethod[6]LIVAKKJ,FLOODSJ,MARMAROJ,etal..Oligonucle‑357-362.[7]杨镇州,李妍,杨雪,等.新型冠状病毒核酸检测试剂盒中酶[8]AZIAHI,RAVICHANDRANM,ISMAILA.Amplificationof[9]ARAKAWAT,PRESTRELSKISJ,KENNEYWC,etal..[10]MANNINGMC,CHOUDK,MURPHYBM,etal..Stability[11]WALTERSRH,BHATNAGARB,TCHESSALOVS,etal..[12]FURUKAWAGT,MANGUMBW,STROUSEGF.Effectsof[13]ASSEGEHEGNG,BRITO-DELAFUENTEE,FRANCOJM,[14]张京芳.低胆固醇鹌鹑蛋黄粉的制备及其生物功能评价初生物技术进展CurrentBiotechnology[17]张建中.应用于即时检测的核酸提取与扩增试剂冷冻干燥[18]侯月娥,伍建敏,王凤求,等.全预混冻干PCR试剂检测草鱼HOUYE,WUJM,WANGFQ,etal..Detectionofgrasscarp[19]KLATSERPR,KUIJPERS,VANINGENCW,etal..Stabi‑[20]TOMLINSONJA,BOONHAMN,HUGHESKJ,etal..On-[21]TAKEKAWAJY,IVERSONSA,SCHULTZAK,etal..Field[22]TAKEKAWAJY,HILLNJ,SCHULTZAK,etal..Rapiddiag‑[23]鲁军,范延超,任晓辉,等.真空冷冻干燥技术在酶制剂等产LUJ,FANYC,RENXH,etal..Applicationofvacuum[24]郑波,王亮.使用新型稳定剂的水痘减毒活疫苗的分装冻干543-546.[25]韦晓玲,刘道杨,潘杰,等.冻干对BMP-2基因重组慢病毒载[26]HASSETTKJ,MEINERZNM,SEMMELMANNF,etal..De‑[27]周铁桩,王磊,黄帅,等.喷雾干燥技术研究进展和展望[J].辽ZHOUTZ,WANGL,HUANGS,etal..Researchprogress[28]黄立新,周瑞君,MUJUMDARAS.近年来喷雾干燥技术研[
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