第四章-紫外可见分光光度法VIP

第四章紫外-可见分光光度法第一节

光学分析概论(P201)一、电磁辐射和电磁波谱二、光学分析法及其分类三、光谱法仪器——分光光度计UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-VIS一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间传播的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二象性波动性：粒子性：C为光速，在真空中c=3×108m/sh为普朗克常数

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列。/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿例如，高锰酸钾溶液吸收黄绿光，呈现紫色，测定波长525nm。CuSO4溶液吸收黄光,而呈现蓝色。高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁

χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁γ射线→

X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长二、光学分析法及其分类（一）光学分析法基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振等（二）分类：

1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法。光谱法分类按照产生光谱的方式吸收光谱法发射光谱法按照产生光谱的物质类型原子光谱分子光谱按照光谱的性质和形状线光谱带光谱吸收光谱法：利用物质吸收光后所产生的吸收光谱来进行分析的方法。发射光谱法：物质中的粒子用一定的能量（如光、电、热等）激发到高能级后，当跃迁回低能级时，便产生出特征的发射光谱，利用此发射光谱进行的分析的方法。

原子光谱主要是由于核外电子能级发生变化而产生的辐射或吸收而产生的光谱。（线光谱）原子光谱图(P213)原子光谱和分子光谱：分子光谱则是由于分子中电子能级及分子的振动、分子的转动能级的变化而产生的光谱。（带光谱）分子光谱图光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外核磁共振紫外可见红外分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光电磁辐射的本质电磁辐射的传递方式(线状光谱)(带状光谱)2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法。分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法3．光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化

原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变

光学分析法分类typeof

opticalanalysis

光分析法光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原子吸收光谱原子发射光谱原子荧光光谱X射线荧光光谱折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法非光谱分析法三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器样品池检测器记录装置第二节紫外-可见吸收光谱法(P271)一、紫外-可见吸收光谱的产生二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型三、相关的基本概念利用紫外-可见吸收光谱来确定物质的组成、含量，推测物质结构的分析方法。又称为紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱法。200~760nm。一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱续前

2．分子吸收光谱的分类：

分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序3．紫外-可见吸收光谱的产生

由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中

价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差）带状光谱？二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的σ键（单键）

π电子→不饱和的π键（双键）

n电子→氧、氮、硫、卤素等含有未成键的孤对电子轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态成键轨道与反键轨道：σ<π<n<π*<σ*COHnpsH图示分子中价电子能级及跃迁示意图成键反键E

*成键反键

*非键n→*→*n→*n→*能量ΔE>≥>

电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷125nm

，乙烷135nm

）E很高，λ<150nm（远紫外区）需在真空测定常作溶剂2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（紫外区）图示续前注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型

→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）举例:碘甲烷等练习①

CH2=CH–CH2–CH2–OCH3；②上述两个分子能产生哪些类型的电子跃迁？①

→*跃迁、→*跃迁、n→*跃迁②→*跃迁、→*跃迁、n→*跃迁三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图。光吸收程度最大处的波长叫最大吸收波长，用λmax表示。高锰酸钾的λmax=525nm。浓度不同时，光吸收曲线形状不同，最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。

2.吸收光谱(absorptionspectrum)的特征Aλ吸收峰↓吸收峰↓谷↓谷↓肩峰(shoulderpeak)末端吸收(endabsorption)

max

max

min

min

sh续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具有π电子和n电子的基团产生π→π*跃迁和n→π*跃迁跃迁需要的能量较低例：C＝C；C＝O；C≡N；—N＝N—

注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强4．助色团（P274表9-2）含有未成键n电子，使吸收峰波长向长方向移动(长移)的杂原子基团。例：—OH，—OR，—NH—，—NH2，—X生色团和助色团生色团(chromophore)：→*、n→*助色团(auxochrome)

：n→*红移(redshift)长移(bathochromicshift)增色效应或浓色效应(hyperchromiceffect)练习①

CH2=CH–CH2–CH2–OCH3；②有哪些生色团和助色团？①生色团：C=C；助色团：–OCH3②生色团：苯环、C=O乙酰苯紫外光谱图CCH3On→p*

;

R带p

→p*

;

K带K带：由共轭双键产生的吸收带，强度大；B带：由苯环产生的吸收带，R带：由生色团及助色团中n→*

产生的吸收带，强度弱续前5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6．增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：

εmax>105→强带

εmin<103→弱带第三节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体续前T=100%时，A=？1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定讨论：二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：

1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）

2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同

3）E↑，物质对光吸收能力↑，

定量测定灵敏度↑→定性、定量依据续前2．吸光系数两种表示法：

1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度

2）百分含量吸光系数

/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度

3）两者关系3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收续前4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰选A=0.2~0.7三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）物理和化学因素（一）光学因素

非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度由于物质对不同波长光的吸收程度不同，因而导致对朗伯-比耳定律的偏离。续前2．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形（二）、溶液本身的物理和化学因素引起的偏离1、由于介质不均匀性引起的偏离

当被测试液是胶体溶液、乳浊液或悬浊液物质时，入射光通过溶液后，除了一部分被试液吸收以外，还有一部分因散射现象而损失，使透光率减小，因而实测吸光度增加，导致偏离朗伯-比耳定律。2．由于溶液中的化学反应引起的偏离

溶液中的吸光物质常因离解、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯-比耳定律。3.浓度过大引起的偏离Beer定律适用的另一个前提：稀溶液(小于0.01MOL/L)浓度过高会使C与A关系偏离定律常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源

1光源热辐射光源用于可见光区，如钨灯\卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯\氘灯。钨灯（波长范围为325~2500nm）氢灯（氢弧灯165~375nm）第四节紫外-可见分光光度计

单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。

2单色器单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。

3吸收池吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。4检测器检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。5信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。二、紫外-可见分光光度计的类型按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。1.单波长单光束分光光度计目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池

→移动误差对光源要求高比色池配对2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。双光束分光光度计：

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高,消除光源、电子测量系统不稳定引起的误差，测量的精确度提高可以自动扫描吸收光谱3.双波长分光光度计双波长分光光度计的优点：是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。双波长分光光度计

特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差第五节定性和定量分析一、定性分析二、定量分析

一、定性分析（一）定性鉴别

定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较续前2．对比吸收光谱的特征值续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：苏丹红1号：1-苯基偶氮-2-萘酚：C16H12N2O续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：

找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：

主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓

杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算

2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06%二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法续前1．吸光系数法（绝对法）练习例：维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度解：练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207,求B12的百分含量。解：练习例：解：续前2．标准曲线法一般常用的标准曲线法步骤如下：1.先将待测样品组分的标准样配成一定浓度的溶液，做紫外可见光谱（A~λ），找出λmax。2.将波长固定在λmax处。测定一系列不同浓度待测样品组分的标准样溶液的吸光值。以溶液浓度c为横坐标，吸光值A为纵坐标，作标准工作曲线。3.未知样品用相同溶剂配成合适浓度的溶液，在λmax处测定其吸光值A未。4.在标准工作曲线上找出对应A未的浓度，再计算未知样品中待测组分的含量。示例

芦丁含量测定0.710mg/25mL续前3．对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时例：精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B