分光光度分析法-

分光光度分析法2024/11/25一吸光光度法基本原理基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。分为:光谱分析法和非光谱分析法。光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下,通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。

2024/11/25在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:红外吸收光谱:分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱:电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱:电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。

2024/11/25一、紫外可见吸光光度法的特点(1)具有较高的灵敏度.一般物质可测到10-10----10-6

mol.L-1.适用于微量组分的测定。(2)有一定的准确度该方法相对误差为2%---5%。(3)操作简便,快速,选择性好,仪器设备简单。(4)应用广泛可测定大多数无机物质及具有共轭双键的有机化合物。2024/11/25二.物质对光的选择性吸收及吸收曲线

分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；溶液之所以呈现不同的颜色.是与它对光的选择性吸收有关溶液的颜色由透过光的波长所决定光的互补:蓝黄绿黄青橙白光青蓝红蓝紫红2024/11/25如果让一束白光通过三棱镜,就分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光,这种现象称为光的色散。每种颜色的光具有一定的波长范围。我们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光,叫做单色光。不仅七种单色光可以混合成白光,如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合,也可以成为白光。这两种单色光就叫做互补色。用不同波长的单色光照射,测吸光度,以吸光度为纵坐标,以光的波长为横坐标作图得到—吸收曲线与最大吸收波长max2024/11/25吸收曲线的讨论:（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax;（2）不同浓度的同一种物质,其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质,它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息,作为物质定性分析的依据之一。（4）不同浓度的同一种物质,在某一定波长下吸光度A有差异,在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大,所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。2024/11/25三、光的吸收定律

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c

二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为:A＝lg（I0/It)=εbc或A＝lg（I0/It)=abc2024/11/25A＝lg（I0/It)=εbc式中:A:吸光度；描述溶液对光的吸收程度；b:液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c:溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；ε:摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；A＝lg（I0/It)=abc式中:c:溶液的浓度，单位g·L－１a:吸光系数，单位L·g－１·cm－１a与ε的关系为:a=ε/M（M为摩尔质量）2024/11/25

透光度(透光率)T

透过度T

:描述入射光透过溶液的程度:

T=It/I0吸光度A与透光度T的关系:

A＝－lg

T

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；

摩尔吸光系数ε(L.mol-1.cm-1)在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；

吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。2024/11/252.摩尔吸光系数ε(比例常数)讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时,ε仅与吸收物质本身的性质有关,与待测物浓度无关；（3）可作为定性鉴定的参数；（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数,常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力,也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。2024/11/25（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。ε>105:超高灵敏；ε=(6～10）×104:高灵敏；ε<2×104:不灵敏。（6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。（7）标准曲线的绘制及应用配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定条件下进行测定。然后以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得到一条标准曲线，也称做工作曲线。曲线的斜率为εb，由此可得到摩尔吸收系数ε；也可根据未知液的Ax,在标准曲线上查出未知液的浓度cx。2024/11/25（7）标准曲线的绘制及应用配制一系列已知浓度的标准溶液,在一定条件下进行测定。然后以吸光度为纵坐标,以浓度为横坐标作图,得到一条标准曲线,也称做工作曲线。曲线的斜率为εb,由此可得到摩尔吸收系数ε；也可根据未知液的Ax,在标准曲线上查出未知液的浓度Cx。2024/11/253.偏离朗伯—比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现:标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离引起这种偏离的因素（两大类）:（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。2024/11/25（1）物理性因素

a.难以获得真正的纯单色光

b.介质不均匀性引起的偏离(2)化学性因素(溶液的化学变化而引起的偏离)

2024/11/25仪器可见分光光度计2024/11/25仪器紫外-可见分光光度计2024/11/25一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区:钨灯作为光源，其辐射波长范围在400～800nm。紫外区:氢、氘灯。发射185～400(200-400)nm的连续光谱。2024/11/25

2.单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝:光源的光由此进入单色器；②准光装置:透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件:将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置:透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。2024/11/253.样品室（比色皿）样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池,可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号,常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理2024/11/25分光光度计仪器的校准1、波长的校准2、吸光度的校正3、杂散光的校正4.比色皿的校正2024/11/25可见分光光度计使用的注意事项（1）每台仪器所配套的比色皿,不能与其他仪器的比色皿单个调换。（2）为确保仪器稳定,在电压波动较大时,应将220V电源预先稳定。（3）当仪器工作不正常时,如数字显示无亮光、光源灯不亮时,应检查仪器后盖保险丝是否损坏,然后检查电源是否接通,再查电路。（4）每次使用结束后,应仔细检查样品室内是否有溶液溢出,若有溢出随时用滤纸吸干,否则会引起测量误差或影响仪器使用寿命。（5）每周要检查一次仪器内部干燥筒内防潮硅胶是否已经变色,如发现已变为红色,应及时取出调换或烘干至蓝色,待冷却后再放入。2024/11/25比色皿使用的注意事项（1）取拿比色皿时,应用手捏住比色皿的毛面,切勿触及透光面,以免透光面被玷污或磨损。（2）被测液以倒至比色皿的约3/4高度处为宜。（3）在测定一系列溶液的吸光度时,通常都是按从稀到浓的顺序进行。使用的比色皿必须先用待测溶液润洗2-3次。（4）比色皿外壁的液体应用吸水纸吸干。（5）清洗比色皿时,一般用水冲洗。如比色皿被有机物沾污,宜用盐酸-乙醇混合液浸泡片刻,再用水冲洗,不能用碱液或强氧化性洗涤液清洗,也不能用毛刷刷洗,以免拐伤比色皿。2024/11/25显色反应的要求选择显色反应时,应考虑的因素灵敏度高、选择性高、生成物稳定、所形成的有色化合物与显色剂之间的差别要大。2024/11/25显色反应条件的选择1.显色剂用量

2.反应体系的酸度3.显色时间与温度4.溶剂

2024/11/25共存离子干扰的消除1、尽可能选用选择性高、灵敏度也高的试剂2、控制酸度，使干扰离子不产生显色反应3、加入掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。4、加入氧化剂或还原剂，改变干扰离子的价态以消除干扰5、选择适当的波长以消除干扰6.萃取法消除干扰7、选用其他能将被测组分与杂质分离的步骤，如：交换离子、蒸馏等8、利用参比溶液消除显色剂和某些有色共存离子的干扰9、利用校正系数从测定结果中扣除干扰离子影响2024/11/25测定条件的选择1.选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时,则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。2024/11/25最佳读数范围与最佳值设:ΔT=1%，则可绘出溶液浓度相对误差Δc/c与其透光度T的关系曲线。如图所示:当:ΔT=1%，T在20%～65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为:Tmin＝36.8%,Amin＝0.434

用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=20～65%(吸光度A=0.70～0.20)。2024