病毒抗性鉴定

《园艺植物生物技术》第九章：蔬菜生物技术研究进展张余洋华中农业大学蔬菜系植物生物技术在蔬菜中的应用蔬菜栽培方面脱毒快繁蔬菜育种方面细胞融合小孢子培养转基因标记辅助选择育种设计育种:通过计算机技术进行分子设计，以实现杂交亲本的最佳配组InternationalService

forthe

Acquisitionof

Agri-biotech

Applications

(ISAAA)一.蔬菜转基因研究进展蔬菜抗病基因工程蔬菜抗虫基因工程蔬菜抗逆基因工程蔬菜品质基因工程延长蔬菜货架期番茄转基因植株的再生（诱导培养基+卡那霉素5mg/L+头孢霉素200

mg/L）花椰菜转基因植株的再生转基因植株在卡那霉素选择培养基上生根1

2

3

4

5

6鄂马铃薯3号转基因试管薯薄片在卡那霉素选择培养基上再生芽马铃薯转基因植株的再生蔬菜抗病毒基因工程病毒来源基因病毒外壳蛋白基因病毒复制酶基因介导抗性病毒核酶（ribozymes）基因,可特异性催化切割RNA 利用核糖体失活蛋白（ribosome-inactivatingprotein,RIP）基因植物来源基因番茄抗TMV基因植物真核翻译起始因子eIF4e外壳蛋白介导的病毒抗性是经典的抗病毒基因工程CMV-CP转基因辣椒（周钟信等,1991；张宗江等,1994）CMV-CP转基因番茄（杨荣昌等,1995）苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMV-CP)转基因番茄（Nilgun等）西瓜花叶病毒（WMV-I）CP基因导入西瓜（唐慧中等,2000）芜菁花叶病毒CP基因（TuMV-CP）转化大白菜（朱常香等,2001）病毒复制酶基因转基因马铃薯（Braun等,1992）miRNA介导的病毒抗性是未来新的研究方向 RNAi和miRNA技术被认为是一种介导病毒抗性极富前景的新技术。 针对CMV病毒2a/2b基因编码区和病毒RNA基因组的3’非翻译区的保守区域,设计miRNA,转化番茄,提高了番茄对CMV的抗性（张晓辉等,2010）。 同时接种TMV和TYLCV后仍然保持对CMV病毒的稳定抗性,人工miRNA能够耐受非目标病毒的干扰。利用人工miRNA培育抗CMV番茄25

nt

miRNA检测

mock

2b

r1

a101

病毒抗性鉴定a1012b

r1mock病毒抗性鉴定CMV接种后ELISA检测CMV接种后ELISA检测蔬菜抗真菌基因工程 用于抗真菌转基因研究的基因包括几丁质酶基因， -1,3-葡聚糖酶基因，植物抗毒素基因，植物抗病基因等，其中几丁质酶基因研究最多。–机制:几丁质酶催化真菌细胞壁的重要成分（几丁质）水解,从而抑制真菌的生长 烟草渗调蛋白(osmotin)基因AP24和菜豆几丁质酶基因双价基因导入番茄，提高转基因番茄对番茄枯萎病菌的抗性（欧阳波等，2005）蔬菜抗细菌基因工程蔬菜抗细菌基因工程主要利用抗菌肽基因等。–机制:在病原细菌的质膜上形成离子通道，从而破坏细胞内外渗透压平衡，细胞内容物尤其是K＋大量渗出，导致细胞死亡。 将抗菌肽基因导入到马铃薯和番茄中，获得对青枯病抗性提高的材料（贾士荣等，1998；田长恩等，2000） 天蚕（Hylophoracecropia）抗菌肽B基因和柞蚕（Antheraeapernyi）抗菌肽D基因构建成双价基因，导入到辣椒栽培种中，获得青枯病抗性提高的转基因辣椒（李乃坚等，2000；余小林等，2000）将辣椒抗根结线虫基因CaMi导入番茄,提高对根结线虫的抗性蔬菜抗线虫基因工程CaMi转基因莴苣对照转基因线虫接种试验蔬菜抗线虫基因工程蔬菜抗虫基因工程细菌来源基因苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因植物来源基因蛋白酶抑制剂基因凝集素基因动物来源基因（用于棉花等作物）蝎毒素基因蜘蛛毒素基因苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因机制:与昆虫消化道特定受体结合，昆虫厌食。原始Bt基因针对密码子偏好差异修饰的Bt基因解决,2000）转Bt基因转Bt基因转双价Bt潜在的害虫对Bt基因产生抗性甘蓝蓝（（毛毛慧慧珠珠等等,,11999花椰椰菜菜（（华华学学军军等等,,11基因因青青花花菜菜（（李李汉汉霞霞966））999977；；钟钟仲仲贤贤等等等,,22001100））Bt转基因青花菜蛋白酶抑制剂基因转蛋白酶抑制剂基因（CpTI）小白菜（佘建明等,2000；杨广东等,2002)将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转入甘蓝,抗虫性增强（雷建军等,2002）基因修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(SCK)导入甜椒,提高对棉铃虫的抗性；转SCK基因大白菜对菜青虫有一定的抗性植物凝集素基因–机制:外源凝集素在昆虫消化道中与肠道的糖蛋白专一性结合，影响昆虫对营养的吸收，从而达到杀虫目的。转雪花莲凝集素基因（GNA）莴苣（郭文俊等，1998）转GNA基因番茄，提高对蚜虫抗性（吴昌银等，2000）转GNA基因大白菜，具抗蚜虫能力（杨广东等，2003）转GNA基因红菜薹（张扬勇等，2003） 由于蚜虫是传播病毒病的一个重要媒介，因此，抗蚜虫转基因蔬菜可能对病毒病的防治具有积极效果。如何解决抗性问题将成为抗虫基因工程的关键 抗虫转基因蔬菜中，若依赖单一抗性基因，昆虫可能产生抗性，应对转基因蔬菜的抗虫性减少昆虫抗性的策略筛选广谱性抗虫基因双价或多价抗虫基因提高外源基因表达活性:特异性和诱导型启动子，特定部位或特定时间表达抗虫基因“高剂量/逃避所”系统:将转基因作物和非转基因作物混种（a）低温对种子萌发的影响（c）转基因株系的种子的发芽率和甜菜碱含量之间的相关性Park

et

al.,

Plant

J,

2004蔬菜抗逆基因工程超量表达胆碱氧化酶基因（

CodA

）提高番茄耐冷性CodA催化合成甘氨酸甜菜碱耐盐转基因番茄叶片中积累盐份,但果实中并不积累Transgenicsalt-toleranttomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruitNature

biotechnology

2001Transgenic

tomato

plants

overexpressinga

vacuolar

Na+/H+

antiport

were

able

togrow,

flower,

and

produce

fruit

in

thepresence

of

200

mM

sodium

chloride.对照转基因5

mM

Salt对照200

mM

Salt转基因200

mM

Salt离子通道蛋白编码基因超量表达CBF1基因提高番茄耐寒性Overexpression

of

CBF1

Improve

Cold

toleranceHsieh

et

al.Plant

Physiol,

2002Transgenic

tomato

plants

overexpressing

CBF1

display

highlevel

of

tolerance

to

chilling

stresses.For

survival

rate

test,

WT,

C5,

C15,

and

C21

were

incubated

at

0

oC

for

7

dand

returned

to

24

oC

for

5

d.转ABRC1::CBF1基因番茄对低温、干旱和渗透胁迫的抗性Transgenic

ABRC1-CBF1

tomato

plantsexhibited

more

tolerance

to

chilling

andosmotic

stresses

than

untransformed

plants.Leeetal.Plant,Cell&Environment26:1181-1190冷害干旱盐胁迫ABRC1: