5-分子生物学研究方法1

第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。第五章分子生物学研究法（上）内容：重组DNA技术回顾DNA基本操作技术RNA基本操作技术基因克隆技术蛋白质组与蛋白质组学技术重组DNA技术史话第一节重组DNA技术回顾三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。

限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶5′末端切除单核苷酸重组DNA实验中常见的主要工具酶1、常用的工具酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。（1）限制性核酸内切酶“分子剪刀”按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型限制性核酸内切酶的类型及特性能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：第二类(II型)限制性内切酶粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：

5’……G’AA|TT_C……3’3’……C_TT|AA’G……5’垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV

的识别位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。第三类（III型）限制性内切酶

DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA连接酶仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆。2、重要的大肠杆菌质粒载体（1）pSC101质粒载体pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。它被选为第一个真核基因的克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，其产量就要比其它质粒载体低得多。（2）ColE1质粒载体ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。

（3）pBR322质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号、又具有低分子量、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。123第一个优点：具有较小的分子量，其长度为4,363bp。由于分子量小，不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。pBR322质粒载体的优点EcoRIAmpR.Tet.RpBR322EcoRITet.RTetracyclineEcoRIReplicaplatingprocessAddAmp.ThecellswewantCell抗生素抗性基因筛选法（4）

pUC质粒载体pUC系列质粒载体包括如下四个部分：(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶的单识别位点；(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基因；(iv)位于lacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ’基因的功能。

第一，更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子缩小了许多，如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。同时，由于rop基因缺失，使pUC8质粒的拷贝数比带有pMB1或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。

第二，可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ'基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。

第三，具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC18质粒载体上。pUC质粒载体优点：pBluescript是专用的商品名称，系指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。

SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。（5）pBluescript噬菌粒载体(i)

在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)

同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii)

编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)

含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。3、重组DNA操作的过程P1725.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。DNA基本操作技术核酸凝胶电泳细菌转化聚合酶链式反应技术实时定量PCRDNA操作技术1、核酸的凝胶电泳自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。碱性条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。凝胶电泳装置琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。分辨力脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘红色荧光，易于鉴定。称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序取样点样电泳检测超螺旋DNA线状双链DNA开环DNAACB"Supercoiled"

(or

"Covalently

ClosedCircular")

DNA

is

fully

intact

with

both

strands

uncut,

and

with

a

twist

built

in,

resulting

in

a

compact

form,

so

they

move

faster

others."Linear"

DNA

has

free

ends,

it

moves

at

the

speed

similar

to

its

molecular

weight,

compared

to

the

markers."Nicked

Open-Circular"

DNA

has

one

strand

cut,

it

is

not

supercoiled,

and

it

is

not

compact

form,

but

it

is

circular.

Therefore,

it

migrates

slower

than

the

above

2

forms.RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform对于未进行酶切的质粒来说，常会出现多条电泳带2、细菌转化转化：异源DNA分子导入受体细胞的过程感受态细胞：处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。受体菌与质粒的选择受体菌：

E.ColiDH5α：无Ap抗性外源质粒

Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力

选择:

如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109、TG1；用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)；+质粒DNA420C热击复苏Amp+细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面。（30min）经短时间420C热击处理（2min）,促进细胞吸收DNA复合物。迅速冰浴1-2min。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间（1h），使抗氨苄青霉素的表型表达后再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。细菌转化（CaCl2法）电击法：电脉冲可以再细胞膜上造成小凹陷，随着电压增大，孔洞变为亲水性孔洞。在孔洞开放的时候，外源DNA容易通过孔洞进入细胞质。噬菌体法：鉴定转化细胞：抗生素抗性结合蓝白斑筛选法其他转化和鉴定方法1、接单菌落到5mlLB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2、5%（250ul)菌液接种到含5mlLB的试管中，370C振荡培养1-2小时，至OD6000.4-0.5（已完成）3、将1.5mL菌液转移到离心管中4、离心5000rpm，40C，5min5、倒出培养液大肠杆菌感受态细胞的制备6.用冰预冷的1mL0.1M的CaCl2处理、悬浮细胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm离心5min，倾去上清9.100uLCaCl2轻轻悬浮，冰浴大肠杆菌感受态细胞的制备受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌--------1ml-----------20min大肠杆菌感受态细胞的制备实验流程以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。3、聚合酶链反应技术PCR四要素：模板DNA、引物、酶、dNTPPCR的基本工作原理PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1.变性(94℃)：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2.退火(55℃)：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸(72℃)：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸模板DNAdNTP

引物Buffer预变性模板DNAdNTP

引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5min94℃变性55℃退火72℃延伸PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。

PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。3）操作简便易行4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学4、实时定量PCRReal-timequantitativePCR实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。4、实时定量PCR

实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种：荧光染料和荧光探针在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。（1）SYBR荧光染料热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理（2）TaqMan荧光探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRRCycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphaseThreshold荧光定量PCR原理－－荧光域值一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系

定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等

绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量检测等

相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：5、重亚硫酸盐测序技术（1）表观遗传学表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等。（2）DNA甲基化在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。CpG岛CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超过200bp。在启动子或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的基因编码有关。正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象。CpG岛以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。（3）重亚硫酸盐测序技术原理6、基因组DNA文库的构建基因组DNA文库的定义

具有代表性的基因文库应该在最大限度上覆盖所有的原始序列。含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。文库大小以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下

N＝ln(1-p)/ln(1-f)

N—基因组文库克隆总数

P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大小的比例

如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下，对人类基因组（3Χ109bp）来说，所需重组体的数目为6.9Χ105；而对于大肠杆菌而言，仅需要1100个重组体。基因组DNA文库的构建流程提取切割整合转化特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况基因组DNA文库基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法基因文库的筛选P189裂解变性显影从基因组文库中筛选目的基因probe放射性核素转印管家基因Vs奢侈基因又称持家基因（house-keepinggenes），是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。管家基因表达水平受环境因素影响比较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。管家基因奢侈基因奢侈基因(luxurygene)即组织特异性表达的基因。这类基因与各类细胞的特殊性有直接的关系,是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因。管家基因Vs奢侈基因第三节RNA操作技术1.总RNA的提取RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。异硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（红色）主要为DNA和蛋白质。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。RNA的评价与鉴定OD260/OD280=1.8~2.0mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与PolyA杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以连抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。2.mRNA的纯化PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图3.cDNA的合成cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo

dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPs核酸酶S1cDNA第二链的自身引导合成法cDNA第二链的置换合成法RNA酶H在杂交体中的mRNA链上造成切口或缺口，EcoliDNA聚合酶I以RNA片段为引物，合成DNA链，取代模板上的mRNA；这些DNA片段经T4噬菌体DNA连接酶连接，形成完整的cDNA第二链。4.cDNA文库的构建cDNA

文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA

片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA

文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA

加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。步骤：在获得高质量的mRNA后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA

插入片断，扩增cDNA

文库、对建立的cDNA

文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。cDNA文库cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。cDNA文库的组建cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选cDNA文库的组建：第四节基因克隆技术在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子便是属于同一克隆。在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。克隆的定义用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。1.RACE技术（rapid-amplificationof

cDNAends）cDNA末端快速扩增技术RACE是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。完整的cDNA

序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成

RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。

用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP

以连有oligo(dG)

的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nestPCR进行检测。（1）5’RACE是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。用RNaseH

降解模板mRNA。用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法继续进行检测和扩增。（2）3’RACE2.应用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，仅以线形形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片断。3.Gateway大规模克隆技术Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应。Gateway基因大规模克隆法利用l噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了保障。TOPO反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体，载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别切割，酶通过其Tyr274与切口处的磷酸基共价相连。加入PCR产物后，形成的3’突出端GTGG，攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，切去GTGG后使PCR产物连入Entry载体。TOPO反应LR反应用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和a