医学免疫学实验一-免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫比浊法检测免疫球蛋白

实验一实验原理免疫球蛋白(Ig)是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免疫应答的主要效应分子。血清免疫球蛋白(Ig)的测定是检查体液免疫功能最常用的方法。通常检测IgG、IgM、IgA，这三类Ig就可以代表血清Ig的水平。疾病评估免疫球蛋白：是广泛存在于哺乳动物血清、淋巴液、组织液和外分泌液中的一种具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体：是B细胞接受抗原刺激后分泌的具有免疫功能的，即能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。所有的抗体都是免疫球蛋白，而免疫球蛋白并不都是抗体。多发性骨髓瘤病人血清中的免疫球蛋白，虽然其化学结构与抗体相似，但通常无免疫功能，不易查到抗体活性，因此不能称之为抗体。免疫球蛋白(Ig)与抗体(Ab)的区别IgG

在正常人血清中含量最多，是体液中最重要的抗病原微生物的抗体（生理），自身免疫病中自身抗体（病理）IgA

抗菌、抗毒素、抗病毒IgM

高能效的抗微生物抗体，感染早期出现IgD

其改变与某些感染和变态反应性疾病相关IgE血清中含量最少的抗体，可以引起I型超敏反应。参与过敏性鼻炎、过敏性哮喘和湿疹等发病机制调节的主要抗体五类免疫球蛋白：（1）几种不同的Ig水平增加：主要见于感染、肿瘤、自身免疫病、慢性活动性肝炎、肝硬化及淋巴瘤等。系统性红斑狼疮(SLE)以lgG、lgA或者lgG

、IgM升高多见，类风湿性关节炎以lgG

、IgM升高多见。（2）单一的Ig水平增加：主要见于多发性骨髓瘤(MM)，表现为仅有某一种Ig异常增高，而其他种明显降低或维持正常。其中以IgG型MM最常见，血清中lgG含量可高达70g/L，IgA型次之，IgD型较少见，IgE型最为罕见。巨球蛋白血症，是产生IgM的浆细胞恶性增生，血清中IgM可高达20g/L以上。血清中免疫球蛋白异常，主要可分为三类：正常参考值：IgG8.0～16.0g/LlgA0.7～3.3g/LIgM0.5～2.2g/L（3）一种或多种Ig水平减少：分为原发性或继发性的，前者属于遗传性，如瑞士丙种球蛋白缺乏症，选择性IgA、IgM缺乏症等。继发性缺损见于网状淋巴系统的恶性疾病、慢性淋巴细胞性白血病、肾病综合征、大面积烧伤烫伤患者、长期大剂量使用免疫抑制剂或放射线照射所致。★免疫电泳

★免疫扩散★免疫比浊检测血清等体液标本中免疫球蛋白的方法：★酶联免疫测定合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG(聚乙二醇)作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定，样品的浊度与其中所含抗原量成正比。免疫比浊：聚乙二醇(PEG)是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，具有高度的亲水性，可以促进免疫复合物形成微粒，没有免疫原性。在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3-4％的PEG，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，过高，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。

免疫比浊法分类免疫比浊法当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱透射比浊法:测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减散射比浊法：光线被粒子颗粒折射，发生偏转，测定光线偏转的角度与发射光的波长检测器检测器光源透镜滤光片平光线散射光透射光

θ散射比浊、透射比浊光路图透射比浊法（Transmissiontubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，在一定范围内吸光度与免疫复合物量成正比。散射比浊法（Nephelometry）

光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。两种方法检测原理：Ab足量，与Ag成正比透射比浊法与散射比浊法优缺点★透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。★散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。样本中IgA、IgG、IgM与试剂中特异性抗体结合

不溶性免疫复合物

反应液产生浊度浊度与样本中IgA、IgG、IgM的浓度成正比在合适光波长（Xnm）处测吸光度概括实验材料免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA,IgG]）免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本微量加样枪、试管酶标仪、水浴箱学生3排，第一排做A-IgA，后两排做G-IgG实验步骤37℃水浴5分钟IgG试剂1（250ul）IgA试剂1（150ul）蒸馏水2ul校准品2ul样本2ul蒸馏水3ul校准品3ul样本3ul混匀37℃水浴5分钟IgG试剂2（85ul）IgA试剂2（50ul)OD

700nmOD

700nm试剂1：tris缓冲液，PEG；试剂2：tris缓冲液，羊抗人抗体实验结果Ig浓度（g/L）=×Ig校准浓度（g/L）样本管吸光度校准管吸光度