《养牛与牛病防控技术》课件-16. 繁殖新技术

养牛与牛病防控技术繁殖新技术任务目标知识目标：能够准确识别肉牛品种；掌握常见肉牛品种的经济类型、外貌特征、生产性能。能力目标：能够结合生产情况选择适宜的肉牛品种；评价品种适应性。素质目标：认识中国肉牛品种与中国自主知识产权的重要性，品种是核心竞争力。小结目前全世界有60多个专门化的肉牛品种，按体型大小和产肉性能，大致可分为下列三大类中、小型早熟品种大型欧洲品种含瘤牛血液的品种5.动物克隆(animalcloning)：利用无性繁殖的方式产生一系列遗传物质完全相同动物的过程。6.胚胎细胞(embryoniccell)：胚胎卵裂球细胞或内细胞团细胞。7.胚胎干细胞(embryonicstemcell)：从胚胎内细胞团或原始生殖腺分离出来的能在体外无限增殖且具有全能性的细胞。

8.细胞全能性(celltotipotency)：细胞所具有的由一种细胞分化形成生物所有的组织细胞（包括生殖腺在内）的能力。9.细胞多能性(cellmultipotency)：细胞所具有的由一种细胞分化形成两种或两种以上细胞或组织的特性。（二）利用胚胎分割法克隆动物(Cloninganimalbyembryosplitting)1．用胚胎分割法克隆动物基本概念（basicconcept）：就是利用机械分割的方法将一个胚胎分割为若干等份，使分割的胚胎都能发育成个体的过程。2、操作程序：

2.基本程序（basicprogram）（1）准备切割器具(prepareinstrumentortool)：显微操作仪、体视显微镜、倒置显微镜、胚胎固定管和分割针（2）处理胚胎(dealwithEmbryo)：将胚胎用链霉蛋白酶处理，软化透明带。（3）分割胚胎(splittingEmbryo)：用机械切割法（刀，针）将胚胎内细胞团或卵裂球分割为若干部分（4）移植细胞于透明带内(transferembryoniccellintopellucidzone)：将多个卵裂球细胞或内细胞团细胞移植入去胚胎细胞的透明带中。

（5）培养胚胎(cultureembryos)：采用受体培养法或体外培养法培养胚胎。受体培养法就是将胚胎放在动物输卵管或子宫角，利用动物体内条件培养胚胎。（6）移植胚胎(transferembryos)：将分割胚胎移植给经同期发情处理的受体动物的子宫角或输卵内。（7）受体动物妊娠和分娩（Thepregnancyofreceptorandparturition）：移植的克隆胚胎在受体动物体内发育，形成克隆动物。

3.胚胎分割法克隆动物研究进展（progressonanimalcloningbysplittingembryo）（1）1904年，Spemann将蛙的胚胎进行分割，获得了同胚双生后代。（2）1930年，Pinus将兔子的单个2-细胞卵裂球培养成为体积较小的亚囊胚。（3）1970年，Mullen分离小鼠2-细胞胚胎卵裂球，获得同卵双生后代。（4）1978年，Moustafa将小鼠桑椹胚分割，获得同卵双生后代（5）80年代，Willadsen对绵羊早期胚胎进行分割，获得四分之一、八分之一分割胚胎后代。（6）1986年，由窦忠英教授完成的我国第一个胚胎分割牛在西北农业大学诞生（四分胚）。（7）1988年，由张涌教授完成的我国第一个胚胎分割二分胚小鼠在西北农业大学诞生。目前已有猪、马、牛、羊、兔、小鼠、人分割胚后代。

4．胚胎分割克隆动物的意义（Thefunctionofcloninganimal）（1）提高胚胎利用率，充分发挥母畜繁殖潜力（2）获得遗传基础同一的个体，为利用后裔评价种畜育种值提供实验材料（3）为胚胎性别鉴定提供材料。（4）为转基因胚胎的鉴定提供实验材料（5）为药物和饲料营养价值的评定提供实验材料，消除遗传因素对实验结果的影响。5．目前存在的问题（Theproblemofanimalcloningbysplittingembryosatpresent）（1）初生重低（Lowofbirthweight）（2）遗传一致性（geneticidentical）（3）所获克隆动物数量少（afewofcloneanimalbysplittingembryo）

（4）先天性畸形，发育不良（三）用细胞核移植克隆动物（cloninganimalbycellnucleartransplantation）1.细胞核移植是指利用显微操作技术将一种动物细胞移入同种或异种动物的去核成熟卵母细胞内，形成核质杂种新细胞。并通过激活，融合，形成胚胎的过程。2.细胞核移植的意义（1）大幅度提高良种动物繁殖效率分割或消化早期胚胎进行移植，能克隆多个子代个体；（2）为外源基因导入细胞（或基因敲除）创造条件；研究基因的功能。（3）为进一步研究细胞核质关系奠定基础；（4）加速动物育种进程避免自然条件下选种动物育种周期长和生育效率低的限制。（5）为动物遗传资源保存提供支撑1）保存细胞就等于保存个体。2）抢救濒危动物（6）用于动物生长发育规律的研究（7）为动物科学、人类医学发展提供同源性实验材料。

（8）为生产转基因动物提供技术支持，利用转基因动物作生物反应器，增加产品数量，提高产品质量，创造新产品，提高畜牧业的生产效率。3.细胞核移植克隆动物技术核质融合与激活胚胎细胞分离妊娠产仔卵母细胞成熟培养胚胎移植卵母细胞去核去核卵母细胞重构细胞胚胎培养细胞核移植克隆动物胚胎4.细胞核移植发展史（1）德国胚胎学家汉斯.施佩曼博士首先提出细胞核移植试验；（2）1952年，美国人罗伯特.布里格斯等利用蛙卵建立了细胞核移植技术，1955年，将豹蛙囊胚细胞核移入去核卵母细胞中，细胞发育为蝌蚪，部分成为成体蛙；（3）1977年，美国杰克逊培育出7只单亲小鼠；1981年，瑞士卡尔.伊尔门泽等首次进行小鼠核移植成功；（4）1997年，英国威尔姆特获得世界上首例体细胞克隆羊“Dolly”国内：（1）1961年，中科院童第周等首次成功进行了鱼类不同亚科间核移植；（2）1980年，中国科学院武汉水生生物所获得鲫鱼核移植幼鱼；（3）1989年，中科院童第周等首次获得核质杂交“鲤鲫核鱼”；（4）1990年，西北农林科技大学首次获得体细胞核移植山羊。目前，我国的核移植研究基本与世界水平接近，许多留学生以第一作者在Nature、Science、PNAS等顶级杂志已发表相关研究论文数十篇。5．用于细胞核移植全能性供体细胞（Thedonortotipotencycellforcellnucleartransplantation）（1）胚胎细胞(embryoniccell)（2）胚胎干细胞(embryonicstemcell)（3）内细胞团细胞(innercellmasscell)（4）原始生殖细胞(primarygermcell)

6．用于细胞核移植的非全能性细胞（1）皮肤上皮细胞(epitheliacell)（2）成纤维细胞(fibroblasticcell)（3）颗粒细胞(cumuluscell)（4）乳腺上皮细胞(mammaryepitheliacell)（5）神经细胞（nervecell）7．细胞核移植克隆动物的分类（ThetypeofcloneAnimalbycellnucleartransplantation）（1）体细胞核移植克隆动物（Cloneanimalbysomaticcellnucleartransplantation）（2）胚胎细胞核移植克隆动物（Cloneanimalbyembryoniccellnucleartransplantation）（3）胚胎干细胞核移植克隆动物（Cloneanimalbyembryonicstemcellnucleartransplantation）（4）内细胞团核移植克隆动物（Cloneanimalbyinnercellmasscellnuclear

）8.细胞核移植克隆动物的技术要点（Thekeymethordofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）分离和培养供体细胞（separatingandculturingdonorcell）（2）获取卵母细胞（Obtainoocyte）（3）体外培养卵母细胞（oocyteculturinginvitro）处理供体细胞(dealwithdonorcell)（4）卵母细胞去核(removeoocytenuclear)（5）将供体细胞注射入去核卵母细胞中

transplantationdonorcellintooocyteremovednuclear（6）融合与激活（syncretizeandactivation）（7）克隆胚胎培养（cloneembryocultureinvitro）（8）胚胎移植(embryostransplantation)（9）生产克隆动物(producecloneanimal)

9.细胞核移植方法（胚胎细胞核移植为例）（1）概念：将未着床的早期胚胎分割或消化分散为单个细胞，并将其注射入去核卵母细胞，使其与去核（染色体）的卵母细胞融合，体外发育成早期胚胎后，移入受体产生后代的技术，称为胚胎细胞核移植。因为是无性繁殖，又称克隆。（2）技术路线

收集卵母细胞早期胚胎体外培养卵母细胞体外成熟胚胎分割或离散获得胚胎细胞注入卵母细胞去核核移植胚胎体外培养移植产生核移植后代（3）方法（以牛卵母细胞核移植为例）

①牛卵母细胞的体外成熟培养

A.获取卵母细胞

采牛、羊卵巢，放入37℃含双抗生理盐水中,6h内运回实验室。用35～37℃的加有双抗灭菌生理盐水清洗卵巢3次,用注射器吸卵巢表面直径为2～5mm卵泡的卵泡液。将抽吸物缓慢注入检卵杯中,静置,检卵。B.筛选卵丘卵母细胞复合体将检出卵丘卵母细胞复合体分级。A级：颗粒细胞层完整且紧密,一般为4～6层,胞质均匀；B级：颗粒细胞层较少,一般为2～4层,胞质均匀；C级：颗粒细胞层不全或为裸卵。只选择A，B级卵丘卵母细胞复合体用于成熟培养。C.卵母细胞成熟培养

牛卵母细胞成熟培养条件为5%CO2，39℃，饱和湿度。成熟培养前2h制作微滴，上盖石蜡油后置CO2培养箱中平衡。用培养液对牛卵母细胞进行成熟培养D.卵母细胞成熟鉴定将培养19～22h的牛卵母细胞分别用D-hank液清洗3遍,放入含有0.3%透明质酸酶的D-hank液内,培养箱中孵育10min，用150μm的毛细玻璃管轻轻吹打以除去颗粒细胞,镜检裸卵母细胞。如果出现第一极体说明卵母细胞已培养成熟，可以进行显微操作。②供体细胞准备采用显微切割或胰酶消化的方法，将囊胚期前的胚胎分成几份或成单个胚胎细胞。③卵母细胞去核显微操作，尽可能将卵母细胞核去掉。去核操作后，培养箱内孵育30min，形态结构完整者用于构建克隆胚胎。⑤重构胚激活将胚胎细胞直接注射入去核卵母细胞后，将其复合体移入M199中洗三次，CO2培养箱中培养30min，待成熟24~26时用化学方法激活重构胚。⑥重构胚体外培养将活化的重构胚放入培养液中，在38.5℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。48h后观察卵裂情况。⑦重构胚移植通过非手术的方法，将发育到桑椹胚或囊胚的重构胚（桑葚胚或囊胚）移入到受体母牛子宫，使妊娠，产犊。（受体母牛处于排卵后第7，8天）。体外重构胚发育情况10.体细胞核移植（1）概念分离组织成单个细胞，将单个体细胞注射入去核卵母细胞中，并通过激活、融合使其分裂、发育形成早期胚胎代的技术，称为体细胞核移植。（2）技术路线

收集卵母细胞组织卵母细胞体外成熟消化离散为单个细胞注射卵母细胞去核培养细胞外源基因转染细胞

核移植胚胎体外培养移植产生核移植后代（3）方法

卵母细胞的获取：同胚胎细胞核移植卵母细胞的成熟培养：同胚胎细胞核移植供体细胞的获取：采用酶消化的方法，从组织中获取单个的结构完整的细胞，作供体细胞。卵母细胞去核：同胚胎细胞核移植细胞核移植：同胚胎细胞核移植激活、融合：同胚胎细胞核移植早期胚胎的培养：同胚胎细胞核移植胚胎移植：同胚胎细胞核移植11.动物克隆存在的问题（theproblemofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）技术尚不成熟，成功率低目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性，技术尚不成熟。如，共克隆绵羊胚胎277，获得1个“Dolly”。（2）死亡率和疾病率高由于是无性繁殖，克隆后代一些隐性有害基因更易显性，寿命、疾病易严重发生。如，“Dolly”仅活5，且患严重关节炎。在操作过程中，可能对细胞造成潜在的危害。（3）有性繁殖是自然进化的结果，克隆是否本身就是倒退？（4）人的克隆有背于社会学和伦理学利用胚胎干细胞核移植生产转基因动物示意图利用胚胎干细胞核移植生产转基因动物示意图二、动物胚胎干细胞与组织干细胞（一）干细胞1.概念干细胞（stemcell,SC)是一类具有无限自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，能在体外大量扩增、冻存而不失其原有特性。2.分类

（1）根据发生学来源分为以下两大类：

胚胎干细胞：是从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养筛选分离出来的具有发育全能性的细胞。它既可以象其它细胞一样在体外培养、增值、冷冻、保存、操作和筛选，又可通过嵌合或核移植参与各种组织的发育，形成克隆动物。

成体干细胞：是存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新且能特化形成组成该类型组织的细胞。目前发现的成体干细胞主要有：造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、胰腺干细胞等（2）根据干细胞分化的潜能大小分类全能干细胞：具有自我更新和分化成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞。多能干细胞：具有具有自我更新和产生多种类型细胞的能力，但却丧失了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如存在于骨髓的造血干细胞科分化出至少12种血细胞。

单能干细胞：具有自我更新能力，只能向单一方向分化，产生一种类型细胞。如鸡肉中的成纤维细胞等。（3）还可以根据干细胞存在的部位分类：如胚胎干细胞、造血干细胞、成骨干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、胰腺干细胞、精原干细胞3.干细胞工程（1）定义：体外分离培养干细胞，并对其进行各种操作的工艺体系，其目的是研究其生物学特性，应用于基础研究和临床治疗。（2）研究范围：1）分离、纯化、克隆、保存干细胞，建立干细胞系；2）研究干细胞的生物学特性，如形态、生长、表达、分化等特性与规律；3）借助干细胞，研究细胞分化形成组织及发育生物学问题；4）干细胞与转基因；5）临床应用，治疗疾病4.干细胞的应用前景（1）作为细胞治疗、组织器官替代治疗的种子细胞；（2）揭示人和动物发育过程中的发育机制及有关影响因素；（3）利用胚胎干细胞克隆动物，提高繁殖效率，保存稀有动物遗传资源，创造新物种；（4）为药物筛选、药理研究及新药开发建立平台；（5）建立各种实验动物模型（6）生产转基因动物的有力工具。（7）研究基因功能的有力工具。（二）动物胚胎干细胞1.概念与特性（1）.胚胎干细胞(embryonicstemcell)概念：从胚胎内细胞团或原始生殖腺分离出来的能在体外无限增殖且具有全能性的细胞。（2）胚胎干细胞的特性①.细胞全能性(celltotipotency)：细胞所具有的由一种细胞分化形成生物所有的组织细胞（包括生殖腺在内）的能力。②.具有无限增殖的能力2.胚胎干细胞的分离与培养的技术路线胚胎干细胞建系的方法很多，主要包括以下几种：（1）从胚胎的囊胚期内细胞团中直接分离胚胎干细胞技术路线：培养胚胎分离出内细胞团离散细胞团形成多个细胞的集落接种在小鼠成纤维细胞饲养层上或也只分化的培养液中---培养，使细胞生长挑出未分化单克隆细胞团离散单个或多个细胞再接种培养、扩增。从胚胎内细胞团分离胚胎干细胞示意图（2）从原始生殖细胞分离和培养胚胎干细胞技术路线：消化人胚胎原始生殖脊---分离出原始生殖细胞接种于小鼠成纤维细胞滋养层上生长----挑出未分化单克隆细胞团-----离散------再接种扩增。（3）利用细胞核移植胚胎分离胚胎干细胞：将成体组织细胞或胚胎细胞、胚胎干细胞注射入去核卵母细胞-----激活，融合---体外培养形成早期胚胎----体外培养成囊胚----消化内细胞团----分离出内细胞团细胞----接种于成纤维细胞饲养层培养---胚胎干细胞集落----挑出未分化单克隆细胞团----离散-----再接种扩增。从核移植胚胎中获取胚胎干细胞3.动物胚胎干细胞分离与克隆方法(1)饲养层制备选择妊娠12-16日龄昆明系小白鼠胎儿制备原代小鼠胎儿成纤维细胞，

①小鼠胎儿的获取与处理断颈处死妊娠母鼠，用75%酒精消毒腹部，用外科手术器械无菌取出胎儿，置于无钙镁PBS中，去除头、四肢及内脏，用无钙镁PBS洗涤3～5次，去除血液，再用眼科剪剪碎胎儿组织备用。②小鼠胎儿成纤维细胞的制备将小鼠胎儿组织置于三角瓶中,加入2-5ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA,室温磁力搅拌器搅拌10-30分钟,将组织消化为糊状,加入3-7ml培养液终止消化,用无菌滤纱将细胞过滤于15ml离心管中,3000rpm离心5分钟,弃去上清液,加入1-2ml培养液,用移液管轻轻吹打细胞团,使细胞离散.再加入5ml培养液,使细胞悬浮,1000转/分钟离心5分钟.弃上清液,③细胞计数准确加入适量细胞培养液,悬浮细胞,取少量细胞悬浮液,按常规法计数④接种细胞:取适量细胞,接种于含有细胞培养液的培养皿中,2-3天换一次细胞培养液.⑤细胞培养:在37℃,饱和湿度,5%CO2中培养.⑥成纤维细胞饲养层制备将铺满皿底的成纤维细胞培养皿中的培养液移去，加入含1μg/ml丝裂霉素C养液(用DMEM+15%NBS配制)，将培养皿置于37°C，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养2～4h；移去丝裂霉素C液，用PBS洗涤培养细胞4～5次，加入4ml0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化1～2分钟，用1ml加样器吹打细胞，使细胞离散，再加入等体积培养液终止消化，制成细胞悬液；将细胞悬液置于离心管1000转/分钟离心4～5分钟，弃去上清液，加入培养液，将细胞浓度调至2～4×105个/ml；在4孔板的每个孔中加入0.6ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养24h；该培养体系用于培养胚胎之前，需更换新鲜培养液。胚胎处理和胚胎培养条件

①采用超数排卵的方法处理动物,选取发情静止期(外阴呈白色)小鼠于晚二十点时腹腔注射PMSG(10IU/只)，48h后腹腔注射HCG(10IU/只)，按1∶1公母比例合笼，次日上午八点以前检查，若母鼠有阴道栓，确认其交配受精，在见栓后84～96h内，用常规方法从子宫冲取胚胎。

②培养液:为DMEM(低糖)+15mL/LNBS+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+0.1μmol/LNa2SeO3+1000IU/mLLIF+10ng/mL胰岛素生长因子。③胚胎的培养将小鼠胚胎置于胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养。培养条件为37℃、5mL/100mLCO2、饱和湿度。牛胚胎培养条件为38℃、5mL/100mLCO2、饱和湿度。若干天后，出现鸟巢状的内细胞团集落。(3)ICM获取:ICM初次传代体外培养ICM细胞6～7天，细胞数量增殖到一定程度后，选择生长集中、隆起明显、呈鸟巢状，形态上仍保持未分化的ICM集落进行传代。具体程序是，用玻璃针剥离ICM表面覆盖的滋养层细胞，再将ICM挑出。用无钙镁离子PBS洗涤一次，置于0.25g/100mL胰蛋白酶+0.04g/100mLEDTA消化液中，在37℃条件下处理3～5min，再转入含血清(15mL/100mL)的培养液中，用毛细管玻璃针拨离，吹打，制备细胞团悬液(每个细胞团含3～10个ICM细胞)。将ICM细胞团悬液接种于铺有新制备饲养层(提前12～24小时制备)的4孔板中。在38℃，饱和湿度和5%CO2的条件下培养，每2-3天更换1次培养液。(5)ES细胞继代克隆培养3-5天后，当饲养层表面出现类ES集落时，弃去培养液，加入无钙镁PBS冲洗2～3次。用玻璃针拨离隆起明显、细胞排裂紧密的ES样细胞集落，使其脱离PMEF饲养层。用吸管将集落转移至消化液中，37℃处理。再将集落移入培养液中，用毛细管玻璃针拨离集落，制成ES细胞块悬液。将ES细胞接种于新鲜饲养层表面，加入培养液，以后每3～5天传代1次。4.动物胚胎干细胞的应用（1）生产克隆动物为克隆动物生产提供供体细胞（2）为医学提供医用材料利用胚胎干细胞，定向诱导分化形成组织，可为器官移植提供材料（3）生产转基因动物：培养胚胎干细胞，并用外源基因转染胚胎干细胞，经过筛选，可获取转基因细胞，以此为材料，克隆动物，可获取转基因动物。改良动物，制备生物反应器。（4）建立药物评价模型：细胞（5）研究细胞分化、组织形成的基本规律（6）研究基因的功能：缺失，突变（7）制备动物模型5.动物胚胎干细胞的鉴定（1）形态：形成胚胎干细胞的典型形态—“鸟巢状”细胞团；（2）生长特性：能无限克隆性生长；（3）标记物：表达胚胎干细胞的多种标记物，如磷酸碱性酶、端粒酶活性高等；（4）分化特性，包括体内、体外分化，具有全能性（5）遗传学特性：核型分析6.胚胎干细胞的诱导分化与发育（1）神经细胞（2）造血细胞（3）肌细胞（4）血管和内皮细胞（5）胰岛细胞。

（6）骨细胞

7.胚胎干细胞研究面临的困难（1）胚胎干细胞体外扩增易发生分化胚胎干细胞无论在体内、外均具有自我分化潜能，极易分化为其它细胞。目前研究添加白血病抑制因子可抑制分化。（2）定向诱导胚胎干细胞分化为功能性器官目前条件、机制不清最近的研究表明，只要将干细胞注射到患病部位，干细胞能自我分化，发挥修复作用。但器官的形成复杂，利用干细胞人造器官任重而道远；（3）胚胎干细胞的安全性问题（4）涉及伦理、社会、道德的争议胚胎的发育历程牛胚胎干细胞源于原始生殖细胞的胚胎干细胞源于胚胎内细胞团的胚胎干细胞1.牛桑椹胚2。牛孵化胚3。牛内细胞团4。小鼠胚胎干细胞集落1。猴胚胎干细胞2。牛胚胎干细胞3。小鼠胚胎干细胞胰腺干细胞集落源于胚胎干细胞的神经样细胞源于胚胎干细胞的网状组织源于胚胎干细胞的成骨细胞四、转基因动物的生产（theproductionoftransgenicanimal）（一）有关转基因动物生产的概念

conceptoftransgenicanimalproduction1.转基因（transgenic）：把分离获得的目的基因导入导受体细胞或受精卵中去的过程。2.受体细胞（receptorcell）：接受目的基因的细胞。3.目的基因（targeticgene）：目的基因也称为目标基因，是指具有特定功能，需要导入到动物基因组或需要进行遗传操作的基因。4.基因组（genegroup）：是指动物个体或群体所包含的所有类型基因的总和。5.转染（transfection）：将目的基因插入受体细胞的基因组的特定部位的过程。6.转化（transformation）：目的基因连接于染色体基因组，并进行表达的现象。7.载体（vector）：携带目的基因的DNA片段。8.转基因动物（transgenicanimal）：是指对动物基因组进行遗传操作（导入目的基因或改变原有基因结构），并使这种改变的遗传信息能够在后代稳定遗传的动物，称为转基因动物。9.动物生物反应器（biologyreactorbyanimalproduction）：能够从血液、乳汁或其它产品中提取和生产具有很高价值的蛋白质的转基因动物。（二）转基因动物生产的程序（theprotocalforproductionoftransgenicanimal）1.分离和克隆目的基因（1）人工合成DNA片段：以已知DNA片段为模板合成DNA。（2）人工合成cDNA

提取mRNA，利用反转录酶以mRNA为模板合成cDNA。（3）由蛋白质推测DNA结构，合成目的DNA片段。外源基因在细胞内的表达：将转基因细胞移植到去核卵母细胞，使其表达外源基因利用胚胎细胞嵌合法生产转基因动物示意图利用胚胎干细胞进行核移植生产转基因动物示意图2.重组DNA（1）将目的基因用连接酶与载体连接。（2）载体连接有标记基因和调控基因。（3）标记基因对某种药物具有抗药性（抗土霉素基因、抗新霉素基因），在含有抗生素培养基中生存的细胞为转基因细胞（携带外源基因），死亡的细胞为非转染外源基因的细胞。（4）调控基因包含有启动子、转录子、增强子和操纵子。（5）重组DNA包含有结构基因、调控基因和标记基因。载体能将目的基因、调控基因和标记基因插入基因组的特定位置。3.克隆重组DNA在体外，利用PCR技术扩增重组DNA，当重组DNA浓度达到一定数量时，用于转染细胞。4.将外源基因导入动物基因组的途径（1）显微注射法利用显微操作仪将重组DNA注射到受精卵原核（雌性原核或雄性原核），卵裂球DNA在复制过程中，将重组DNA整合到胚胎DNA中。这种导入重组DNA的方法操作繁琐，基因整合随机性强，转基因效率低。（2）精子载体法先将重组DNA用一定方法处理，再将重组DNA与精子共同孵育，使重组DNA进入精子内，利用受精过程将重组DNA导入到受精卵。优点是操作简单，缺点是整合效率低。（3）反转录病毒感染法将外源基因插入到反转录病毒RNA特定部位，利用病毒感染细胞，将重组DNA携带入受体细胞，并进一步整合至细胞基因组。优点是操作简单，整合效率高，单位点、单拷贝整合。缺点是携带外源基因长度不能超过15kb。（4）SV40载体（Vectorofsimianvacuolatingvirus40，SV40，猿猴空泡病毒载体）。（5）乳头状瘤病毒载体法（papilloma）（6）腺病毒载体法（adenovirus）（7）胚胎干细胞介导法（introductionoftargetgenebyEScell）将重组DNA导入胚胎干细胞，利用胚胎干细胞核移植或胚胎嵌合的方法生产转基因动物。（8）体细胞介导法（introductionoftargetgenebysomaticcell）将重组DNA导入体细胞，利用体细胞核移植的方法生产转基因动物。5.将外源基因导入细胞的方法（1）磷酸钙沉淀法将外源基因与CaCl混合，再加入Hepers-磷酸盐缓冲液，制备DNA-磷酸盐沉淀物，将沉淀物移至单层细胞表面，进行培养，使外源基因转移至动物细胞内。（2）DEAE-葡聚糖转基因技术将二乙胺基葡聚糖（diethylaminoethyl-dextran，DEAE-dextran）与重组DNA混合，加入细胞表面，外源基因就会进入动物细胞内。（3）电脉冲法将DNA与经秋水仙素处理的细胞混合，用高压脉冲电流刺激细胞，使细胞膜瞬间打开，使重组DNA进入受体细胞。（4）脂质体载体介导法；利用脂质体包埋重组DNA，将其与经PGE处理的细胞共同培养。6.转基因细胞体外培养（cultureoftransgeniccellinvitro）7.转基因细胞的筛选将细胞在特定培养基中培养，能存活的即为携带外源基因的细胞。对转染外源基因的细胞进行筛选筛选转染外源基因细胞的程序8.外源基因整合、转录和表达的检测（1）Southern杂交制备目的DNA探针（以目的DNA为模板，以经过标记的碱基为原料，利用PCR技术，扩增生产目的DNA探针），从细胞中提取并纯化DNA，扩增DNA，酶切DNA，变性、电泳、转移目的DNA片段，用目的DNA探针进行杂交，阳性者为目的DNA已整合到基因组中。（2）Northern杂交目的DNA探针与受体细胞mRNA杂交，呈阳性者，为外源基因已经转录。（3）Western杂交标记蛋白质与受体细胞蛋白质杂交，呈阳性者，为外源基因已经翻译。（4）免疫法9.转基因胚胎的生产（1）转基因细胞核移植法（2）胚胎嵌合法10.诱导发情与胚胎移植11.受体动物妊娠、分娩产生转基因动物12.转基因动物品系或品种的建立选种、选配，固定目的基因，使其稳定遗传

（三）转基因动物生产研究的意义（Thefunctionoftransgenicanimalproduction）1.研究细胞基因结构与功能的关系2.研究基因转录、基因表达的调控机制3.研究动物细胞分化以及组织、器官和个体发育的调控机制4.创建人类遗传疾病的动物模型，为疾病的治疗提供实验材料5.提高家畜生产力（转生长激素基因动物）6.提高家畜产品品质（转瘦肉基因，肥胖基因）7.培育抗逆性强的动物品种（病毒衣壳蛋白基因，热应激蛋白基因）8.制备生物反应器（乳、血液）9.可供移植用的组织器官（四）存在问题（Theproblemoftransgenicanimalproduction）1.效率低，成本高2.外源基因随机整合，异常表达3.发病率高（五）发展趋势（thetendencyofdevelopmentfortransgenicanimal）1.提高效率，降低成本2.简化操作3.进行基因定位操作与整合研究4.进行基因共适应性研究5.进行相关应用研究正常小鼠与转基因（生长素）小鼠五、性别控制技术的基本概念(basicconceptofsexcontrol)1.性别控制：通过人为控制的方法，使成年动物繁殖出人们期望得到的雌性动物或雄性动物的方法，称为性别控制2.性别控制的理论基础（1）动物的性别主要取决于精子的类型，哺乳动物，y精子与卵子结合，产生雄性动物，X精子与卵子结合，产生雌性动物。在家禽，雄性为ZZ型，雌性为ZW型。（2）动物雄性配子与雌性配子理化性质不同。密度、带电量、对环境需求的差异。（3）y精子性别决定基因含有SRY序列（sexdetermingregionoftheYchomosome，SRY），该序列可编码性别决定蛋白。（4）雄性动物和雌性动物在性别发育中所需环境不同。例如，水温变化与鱼类性别密切相关。（5）伴性遗传控制某些性状的基因与性别决定基因连锁，或性别决定基因的表达对某些性状的表达产生影响。

3.性别控制技术的意义（1）及时淘汰或终止不需要性别的动物，提高畜牧业生产效益。（奶牛，奶山羊、蛋鸡雌性后代价值高，雄性价值低，肉牛、肉猪、肉鸡雄性生长速度快）（2）转基因动物生产在转基因动物生产中，雌性动物具有利用价值，雄性动物利用价值小。（3）胚胎移植异性胚胎移植经常导致孪生不育。（4）增加所希望的性别动物的比例，有利于提高选种强度。（5）预测性别，预防伴性遗传病的发生。（二）性别控制的方法（Themeasureofsexcontrol）1．特异性杀灭雄性（Y精子）（1）酸碱度调节法酸性环境有利于x精子存活，碱性环境有利于y精子存活，调节母畜生殖道内环境酸碱度，以杀灭不需要的精子。（2）抗原—抗体法：制备Y精子抗体，输精时在精液中加有Y精子抗体，可特异性杀灭Y精子。（3）食物调节法

2．精子筛选法（1）密度梯度离心法：根据x精子和Y精子密度的差异，采用梯度离心法将x精子和Y精子分离。（2）电泳法：根据x精子和Y精子表面携带电荷与质量的差异，采用电泳法将x精子和Y精子分离。（3）流式细胞器分离法根据x精子和Y精子DNA含量的差异，用DNA特异性染料对精子进行活体染色，用激光束照射染色后的精子，发光强的为x精子，发光弱的为Y精子，感光系统将这种光信号传递给计算机，计算机控制充电器，给发光强的x精子带正电荷，发光弱的Y精子带负电荷，当带电荷的精子通过电场时，就可将x精子和Y精子分离。

3．胚胎性别鉴定法（1）核型分析法采取少量胚胎细胞，用秋水仙素处理，制片，显微摄影，进行核型分析。（2）SRY基因探针检测法利用SRY-PCR（聚合酶链式反应）体外扩增SRY基因探针。提取胚胎细胞DNA，以SRY基因的一段碱基为引物，以胚胎细胞DNA为模板，扩增含SRY基因有胚胎细胞DNA，对扩增产物进行Southern杂交，出现阳性者，为雄性胚胎，出现阴性者，为雌性胚。（3）免疫学法：Y精子中含有雄性特异性组织相容性抗原（malespecificminorHistocompatibilityYantigen，简称H-Y抗原）。从雄性动物体内提取H-Y抗原）。从雄性动物体内提取H-Y抗原，将该抗原接种免疫雌性动物，产生抗H-Y抗原的血清。或利用细胞融合法制备H-Y抗原单克隆抗体。在培养液中添加H-Y抗原抗体或H-Y抗原的抗血清，发育停止或死亡的胚胎为雄性胚胎，能够发育的为雌性胚胎。（4）荧光免疫法A为H-Y抗原单克隆抗体，B为用荧光标记的山羊抗小鼠

求蛋白，C为雄性胚胎细胞H-Y抗原。将A加入培养液中培养胚胎，形成A-C复合体，再将B加入胚胎细胞表面，雄性胚胎可形成B-A-C复合体，雌性胚胎不可能形成B-A-C复合体。在荧光显微镜下，B-A-C复合体显荧光，显荧光的胚胎为雄性胚胎。六、动物胚胎嵌合技术（一）有关概念（Theconceptofchimeraanimal）1.动物嵌合体（chimeraanimal）：由两种或两种以上基因型细胞构成的动物。2.分类（1）种内嵌合体（2）种间嵌合体（二）嵌合体动物的生产productionofMammalianchimeras1.获得供体细胞（1）胚胎卵裂球（Blastomere）（2）胚胎内细胞团细胞（Innercellmass，ICM）（3）胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）(4)畸胎瘤细胞（embryoniccarcinomacell，ECC）2.将多个供体细胞注射入受体胚胎中或将两个胚胎内细胞团聚集在一起，装于空透明带中。3.培养胚胎：37℃,5%CO2,饱和湿度，细胞培养液（DMEM)4.进行嵌合体鉴定（1）毛色等外型鉴定；（2）生化指标如同功酶鉴定：用报告基因标记⑴绿色荧光蛋白基因（GFP）;⑵β-半乳糖苷酶基因(LacZ）;⑶氯霉素乙酰转移酶基因(CAT);⑷人生长激素基因(hGH)（3）分子杂交（4）测交试验：40~100%毛色嵌合♂鼠与供胚来源品系♀

5.进行胚胎移植（三）意义

ThefunctionofproductionofMammalianchimeras1.生产转基因动物2.抢救濒危稀有动物3.培育新品种4.研究基因结构与功能的关系5.生产人造组织器官用聚合法生产嵌合体动物示意图利用三明治法生产嵌合体胚胎示意图毛色嵌合体β－半乳糖苷酶

标记嵌合体动物（beta-galactosidase