肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法-编制说明

一、项目来源根据《广西标准化协会关于下达2022年第十八批团体标准制修订项目计划的通知》（桂标协〔2022〕56号）精神，由广西壮族自治区药品监督管理局提出，广西壮族自治区食品药品检验所、广西-东盟食品检验检测中心、广西爱生生命科技有限公司、深圳华大智造科技股份有限公司共同起草的团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》（项目编号2022-1801）获批立项。二、项目背景及目的意义禽肉是我国第二大肉类消费品。我国肉类消费常年稳定在8000万吨以上，主要以猪肉、禽肉、牛肉和羊肉为主。根据国家统计局公布的数据显示，2019年我国居民人均肉类消费量为26.91kg/年，其中人均猪肉消费量为20.28kg/年，人均牛肉消费量为2.2kg/年，人均羊肉消费量为1.19kg/年，人均禽类消费量为10.8kg/年。2020年我国居民猪牛羊肉人均占有量37.38kg/年。随着我国国民经济水平及人民生活水平的大幅提高，动物源性食品在我国城乡居民的日常膳食消费中所占比例逐年增长，同时消费者对动物源性食品的质量安全越来越关注。近年来部分不法分子为了追求高利润，用价格低廉的肉类替代产品标签中的高价肉类，对消费者造成欺诈，严重影响及破坏食品安全秩序。牛肉在世界肉类消耗中排名第三，牛肉中含有大量的蛋白质和氨基酸，牛肉的肉类结构组织更适合人类的需要，可以增加人体的抗病能力，对于长身体的孩子来说非常有益。牛肉可以起到补血的功效，缺血可以用牛肉来补。牛肉也是食肉朋友的最爱，在美国等国家牛肉成为主食，甚至美式早餐中都有牛肉的身影。第一种，用其他肉类来代替牛肉。用廉价的肉类来代替牛肉是商贩最常用的手段，多是用鸡肉和鸭肉这类肉来代替，有的会用猪肉代替。或许会有疑问，为什么这类肉会有牛肉的味道呢？制作假牛肉是会放入牛肉精添加剂，加入牛肉精后肉类的颜色和光泽会变得和不相上下，最后再用肉精膏涂抹均匀，这样制作出的假牛肉简直和真牛肉一模一样。第二种是合成肉，这类肉多是用牛肉的边角料，或者用其他肉类、烂肉做出。制作这种假牛肉更是简单，只需将碎肉用类似于“粘合剂”的添加剂粘合起来，就成了以假乱真的牛肉了。这种牛肉多会制作成价格低廉的牛排、烤肉中的牛肉片、火锅中的肥牛等。第三种是利用各种烂肉、内脏风干制成的牛肉干。这种肉含有大量的添加剂，对人体伤害非常大。目前国内外用于肉制品的掺假检验以PCR-RFLP、多重PCR、实时荧光PCR等方法为主。然而，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法全面分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，当遇到几个不同品种的混合样品时，要确定每个品种在混合物中的相对量需要找到品种中唯一的已知目标序列作为参考序列，要获得精确的测定结果非常困难，并且现有检测方法难以满足高效快速、批量大、大规模、操作简单等检测需求，无法满足市场监管、企业原料及成品质量实时控制的迫切需求。因此，制定团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》十分必要和紧迫。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》项目任务下达后，广西壮族自治区食品药品检验所牵头组织成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作，具体由广西壮族自治区食品药品检验所、广西-东盟食品检验检测中心、广西爱生生命科技有限公司、深圳华大智造科技股份有限公司相关人员配合。（二）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关实验室生物安全和高通量测序的相关技术文献资料。主要有：SN/T2557-2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分：动物组织样本预处理GB/T35537高通量基因测序结果评价要求GB/T40664用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为扩增子测序法的检测原理、试剂和材料、主要仪器设备、样本采集与处理、检测方法、结果分析及判定。（四）调研及形成草案、征求意见稿、2022年7月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关高通量测序的要求，并结合动物源性成分检测方法实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》（草案）。2023年3月，标准编制工作组对前期的研究和数据进了整理并结合前期技术咨询会、征求意见会、技术审查会的内容针对扩增子测序法进行多次讨论、研究，最终形成团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》（征求意见稿）和编制说明。四、标准制定原则（一）实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析动物源性成分检测方法当前现状，调研高通量测序分析方法情况，在现有国家、行业标准相关动物源性成分检测方法要求的基础上，结合多年经验而总结起草的。符合当前动物源性成分检测方法的方向与需求，有利于行业的长远发展，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性原则本文件编写过程中注意了与高通量测序方法相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则本文件严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。（四）前瞻性原则本文件通过扩增子测序法，验证分析肉类样品，建立动物源性产品中肉类掺假检测分析平台，弥补扩增子高通量测序法在标准领域的缺失，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，作为对动物源性成分检测方法的指导。五、标准主要章节内容及确定依据团体标准《肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法》主要内容包括术语和定义、要求、检测原理、试剂和材料、主要仪器设备、样本采集与处理、检测方法、结果分析及判定。自2012年起，广西壮族自治区食品药品检验所就开始对肉类产品中动物源性成分进行检测，完成几百份样品的检测分析，数据量丰富，在不断的试验过程中试验方法得到不断完善，最终形成准确度高、可操作性强的动物源性成分检测方法。本标准采用高通量测序法对动物源性成分进行测定。术语和定义高通量测序high-throughputgenesequencing主要依据GB/T30989《高通量基因测序技术规程》3.19的“高通量测序high-throughputgenesequencing”术语和定义的要求。原理选取线粒体16SrRNA基因中的特殊区域作为动物物种的遗传标记，包括可变区和保守区，可变区用于在属或种水平对动物物种进行分类。采用带有index序列的特定引物，对待测样本的DNA样本进行PCR扩增建库，并对所构建的文库进行高通量测序。然后，通过对测序数据进行生物信息学比对，分析能比对到物种数据库中对应的物种及其数据量比例，即可对混合样品中的各成分进行准确定性和定量分析。试剂除另有规定外，所有试剂应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682一级水的要求。CTAB提取液：CTAB20g/L，氯化钠1.4mol/L，Tris0.1mol/L，EDTA20mmol/L，pH8.0，121℃高压灭菌20min。使用前加入终浓度为2%的β-巯基乙醇。CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化钠0.04mol/L，pH8.0，121℃高压灭菌20min。测序试剂盒：根据测序目标和平台，选用相应的试剂盒。标准文库试剂：基于测序平台，选用相应的标准文库。仪器设备磁力架，孔径：12mm；适用于1.5-2mL离心管。移液器，单道可调量程移液器0.1-2.5μL、0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL。PCR仪。Qubit®Fluorometer。高速冷冻离心机。恒温水浴锅或金属浴。-20℃冰箱。核酸浓度测定仪器。电泳仪。凝胶成像系统。高通量基因测序仪：基于不同的测序平台，选用合适的测序仪。Bioanalyzer芯片生物分析仪。样本采集与处理1.样本采集要求样本的采集、运输、放置过程中应尽量避免受到其它种类样本的污染。在采样过程中应确保采样器具清洁、干燥、无异味。采样、制样器具及样本容器所用材质不应对采集样本造成污染。为了避免交叉污染，尽可能使用不同的采样器具采集不同的样本，盛装样本的容器或包装应尽可能一次性使用。本标准中检测样本为动物组织及其产品，采样要求参照GB/T5009.1中8的要求。2.样本处理要求动物组织样本处理应符合GB/T33681.1的要求，并按8.1中核酸制备样本处理步骤进行前处理。加工食品的前处理方法宜参考SN/T2557-2010中的要求。检测方法1.核酸提取（1）样本应提取全基因组DNA，提取方法宜参考附录A或者按照所使用的商业化试剂盒说明提取。（2）提取后的核酸应进行质量评价，使用合适的核酸浓度测定仪器（如紫外分光光度计，nanodrop等）测定OD260/OD280，比值为1.5～2.0，基因组的完整性和浓度应符合GB/T40664-2021中4.2要求。2.建库与高通量测序（参考附录B或附录C）（1）扩增区域应选择线粒体16SrRNA基因上一段连续的，在不同物种间变异程度较高的区域。扩增区域应在样品可能包含的物种间具有较高的差异性，且应包括至少一个高可变区。扩增区域应符合测序策略要求的片段大小。（2）将待测序文库应进行质量控制检测。按照琼脂糖凝胶电泳方法或者荧光定量方法进行文库质控，文库质检时，文库的片段大小分布应符合预期，文库浓度应不低于1.2ng/μL。建库过程中宜设置阴性对照与阳性对照。（3）将多个质检合格的文库混合，选择适合的工作流程进行测序。测序应遵照DNA测序仪的操作规范进行。测序策略应与扩增子大小相匹配，测序条件应进行合理控制，使数据质量达到测序平台要求。（4）测序结果应符合GB/T35537-2017要求。结果分析及判定根据需要鉴定的物种拉丁名在NCBI数据库(/nuccore)中获取各个物种的特异性序列，构建用于本地数据分析的物种数据库。高通量测序得到的数据中，筛选有效OTU的前50个碱基序列，与物种数据库基因序列进行比对，相似度100%的物种则为该肉类样品中的有效成分；统计各成分物种有效OTU的reads数，得到不同物种的百分比例，认为该比例是该肉类样品中各成分的比例，精确定量可参考各物种中参考基因的拷贝数与质量对应表推算。1.数据质控样本经过测序得到的原始数据，应进行质量控制，去除含有接头或者低质量的序列和外源基因组序列，再进行后续生物信息学分析。2.软件测序结果比对（1）定性比对分析：使用AnimalDNAMetabarcodingAnalysis软件，将质控得到的样品数据FASTQ文件，比对物种基因组数据库，分析得到物种的拉丁名和基因序列。（2）定量比对分析：使用AnimalDNAMetabarcodingAnalysis软件，统计比对到各成分物种基因序列中前50个碱基的比例，该比例认为是样品中各成分的比例。3.网页测序结果比对登录动物DNA宏条形码鉴定分析平台（:9003），完成测序结果分析。方法的准确度选取9个不同物种进行检测，按试验方法，使用不同品牌测序仪在2家实验室进行比对试验，测定结果见表1。分析结果与样品组分一致，而且同一样品在2家实验室使用不同品牌测序仪获得的测试结果一致。说明本方法的准确度好，具有普遍性，适合推广使用。表1样品准确度检测结果实验室/测序仪编号组分测序结果总Reads数鉴定物种物种比例广西壮族自治区食品药品检验所/IlluminaMiseqzhu猪318813Sus_scrofa100.00%ji鸡25836Gallus_gallus100.00%niu牛80729Bubalus_bubalis100.00%mao猫19852Felis_catus100.00%ge鸽52306Columba_livia100.00%shu鼠29863Mus_musculus100.00%yang羊358281Ovis_aries100.00%xia虾83754Penaeus_latisulcatus100.00%ya鸭27632Anas_platyrhynchos100.00%深圳华大智造科技股份有限公司/MGIDNBSEQ-E25zhu猪1070046Sus_scrofa100.00%ji鸡621948Gallus_gallus100.00%niu牛1019269Bubalus_bubalis100.00%mao猫1472329Felis_catus100.00%ge鸽481137Columba_livia100.00%shu鼠725382Mus_musculus100.00%yang羊1016920Ovis_aries100.00%xia虾718355Penaeus_latisulcatus100.00%ya鸭1057980Anas_platyrhynchos100.00%方法的精密度按实验方法对混合有不同物种的2个样品进行测定，选取3家实验室进行比对试验，分别得出2个平行样的测定结果,见表2。从测定结果可以看出，其相对标准偏差(RSD值)均小于8％，说明方法的精密度高。而且在重复条件下3家实验室获得的测试结果的RSD值均小于2％。表2样品精密度测定结果实验室/测序仪编号组分（比例/%）测序结果Reads数鉴定物种（比例/%）平均值（％）RSD（％）广西壮族自治区食品药品检验所/IlluminaMiseqHE-1牛：50羊：5050902Bos_taurus:51.74Ovis_aries:48.26Bos_taurus:52.29Ovis_aries:47.71Bos_taurus:1.49Ovis_aries:1.63HE-2牛：50羊：5034778Bos_taurus:52.84Ovis_aries:47.16HF-1牛：99羊：124886Bos_taurus:98.23Ovis_aries:1.77Bos_taurus:98.32Ovis_aries:1.68Bos_taurus:0.13Ovis_aries:7.58HF-2牛：99羊：149670Bos_taurus:98.41Ovis_aries:1.59广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部）/IlluminaMiseqHE-1牛：50羊：5033567Bos_taurus:53.01Ovis_aries:46.99Bos_taurus:52.78Ovis_aries:47.22Bos_taurus:0.60Ovis_aries:0.67HE-2牛：50羊：5060956Bos_taurus:52.56Ovis_aries:47.44HF-1牛：99羊：179037Bos_taurus:98.56Ovis_aries:1.44Bos_taurus:98.58Ovis_aries:1.42Bos_taurus:0.03Ovis_aries:1.99HF-2牛：99羊：147236Bos_taurus:98.60Ovis_aries:1.40深圳华大智造科技股份有限公司/MGIDNBSEQ-E25HE-1牛：50羊：501015420Bos_taurus:52.23Ovis_aries:47.77Bos_taurus:52.69Ovis_aries:47.31Bos_taurus:1.23Ovis_aries:1.38HE-2牛：50羊：503434882Bos_taurus:53.15Ovis_aries:46.85HF-1牛：99羊：1849283Bos_taurus:98.30Ovis_aries:1.70Bos_taurus:98.27Ovis_aries:1.73Bos_taurus:0.04Ovis_aries:2.45HF-2牛：99羊：12683836Bos_taurus:98.24Ovis_aries:1.76六、国内外同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系经查阅，与肉类产品动物源性成分检测方法相关的国家标准、行业标准及地方标准有：SN/T2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》、SN/T2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》、SN/T37