微生物学检验技术 课件 33-0综合技能训练：实验室生物安全与质量控制

综合技能训练实验室生物安全与质量控制学习目标1．掌握实验室生物安全规程与实验室操作技术。2．熟悉实验室设备和仪器使用规程、实验室意外事件或事故处理方法。3．了解废弃物处理原则。4．能按照目前临床微生物实验室的工作内容，合理运用质量衡量方法。5．能对微生物实验室进行正确的室内质量控制和室间总量控制。综合技能训练

实验室生物安全与质量控制综合技能训练

实验室生物安全与质量控制一、微生物实验室生物安全管理综合技能训练

实验室生物安全与质量控制一、微生物实验室生物安全管理概述

新的感染性病原体的不断涌现，抗生素的耐药性问题日益严重，新的诊断和治疗技术的应用，以及生物恐怖的潜在危险，提高实验室的生物安全再一次成为人们的关注点。生物安全防护包括安全设备、个体防护装置和措施，实验室的特殊设计和建筑要求，严格的管理制度和标准化的操作程序及规程。其中，规范的微生物学操作技术是实验室生物安全的基础，专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。一、微生物实验室生物安全管理（一）实验室生物安全规程

1.进入规定（1）在实验室入口处贴生物危害警告标志，注明生物安全水平、负责人，电话等信息。（2）未经许可，非工作人员不得进入实验室。外来合作者、进修和学习人员在进入实验室之前必须经过部门负责人的批准。（3）实验室总门应保持关闭状态。（4）与实验室工作无关的动物不得带入实验室。一、微生物实验室生物安全管理（一）实验室生物安全规程

2.个人防护（1）工作服：在实验室工作时，必须穿着工作服。（2）手套：在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料的操作时，应戴上合适的手套。脱手套后必须洗手。用过的一次性手套应丢入感染性废物袋内（贴有生物危险Ⅱ级标志的黄色垃圾袋）。（3）洗手：在处理完感染性材料后，以及在离开实验室前，都必须洗手。实验人员按六步洗手法洗手或用免洗手消毒液进行手卫生消毒。至少40秒钟，纸巾擦干。（4）其他防护：当有可能受到喷溅物污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害时，必须戴合适的安全眼镜。一、微生物实验室生物安全管理（一）实验室生物安全规程

2.个人防护（5）不得穿着实验室工作服离开实验室。（6）不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。（7）禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。（8）禁止在实验室工作区域内储存食品和饮料。（9）在实验室内用过的工作服不得和日常服装放在同一柜子内。一、微生物实验室生物安全管理（一）实验室生物安全规程

3.实验室工作区（1）实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。（2）每天工作结束之后，必须用爱尔施牌消毒片(成分：三氯异氰尿酸，每片含有效氯500mg，按每片1000ml水比例进行溶解)消毒工作台面。用75%酒精消毒生物安全柜台面。活性物质溅出后要随时消毒，消毒剂为爱尔施（1片/1000ml），严重污染时(血液等标本的污染)，将6片爱尔施溶于1000ml水（3000ppm）用以消毒。（3）所有受到污染的材料、标本和培养物应废弃于感染性废物袋内，而生活垃圾应弃于黑色垃圾袋，不能混淆。需要清洁再利用的材料，必须先经高压灭菌处理。（4）需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。一、微生物实验室生物安全管理（二）实验室操作技术

1.标本的安全操作（1）标本容器：标本用防漏的有盖的塑料容器盛装，容器上贴标签。化验单不能卷在容器外面，而是要分开放置；（2）标本接收：在实验室专门的接收窗口接收标本；（3）打开包装：容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。容器有破碎或标本泄漏时，根据标本拒收SOP予以拒收，并填写拒收单。一、微生物实验室生物安全管理（二）实验室操作技术

2.实验室的基本安全操作所有标本在生物安全柜内操作，要尽量减少气溶胶和微小液滴形成。在工作台面放置一块浸有消毒液的纱布，使用后按感染性废弃物处理。一、微生物实验室生物安全管理（二）实验室操作技术

2.实验室的基本安全操作一、微生物实验室生物安全管理（二）实验室操作技术

3.实验室的其他安全操作（1）血清分离1）操作时应戴手套及防护眼镜。2）血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸移液管。3）移液管使用后应完全浸入消毒剂中浸泡30min。然后高压灭菌（121℃1-1.5bar20min）,清洗消毒后备用。4）带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后放入感染性废物袋内高压灭菌。5）备消毒剂清除喷溅和溢出标本。一、微生物实验室生物安全管理（二）实验室操作技术

3.实验室的其他安全操作（2）装有冻干感染性物质安瓿的开启1）在生物安全柜内操作。2）首先用75％酒精清洁安瓿外表面。3）如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。4）用75％酒精浸泡的纱布将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。5）将顶部小心移去，放入锐器盒内。6）如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去，弃于感染性废物袋内。7）缓慢向安瓿中加入营养肉汤以重悬冻干物，避免出现泡沫。一、微生物实验室生物安全管理（三）实验室设备和仪器

1.生物安全柜（1）操作步骤：开启电源和内外风扇，在机器预热时将所有必需的物品置于安全柜内。开始工作前及完成工作后，让安全柜工作5min来完成“净化”过程。手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以使安全柜调整完毕才开始对物品进行处理。接种环灭菌时，用电子加热器，而不应使用明火，在实验结束时，生物安全柜里的所有物品都应清除表面污染，标本和培养基移出安全柜。每天实验结束时，用75%酒精擦拭工作台面、四壁及玻璃的内外侧等部位来清除污染。有标本溢出等污染时，用爱尔施消毒，然后用水再次进行擦拭。一、微生物实验室生物安全管理（三）实验室设备和仪器

1.生物安全柜（2）注意事项：每次开始实验之前将所需物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出次数。双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口，尽量减少操作者身后的人员活动，生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。Ⅱ级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸、仪器设备或其他物品阻挡，所有物品应尽可能地放在靠近工作台后缘的位置，但不阻挡后部格栅。可产生气溶胶的设备（如混匀器、离心机等）应靠近安全柜的后部放置，生物危害性废弃物袋放在安全柜内右侧，袋中放入爱尔施消毒剂。房间中有人时要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害，安全柜一直维持运行状态（8小时工作期间），不能反复开关，当气流警报响起时，立刻停止工作，并报告生物安全负责人。一、微生物实验室生物安全管理（三）实验室设备和仪器

2.低温超速离心机按照操作手册操作离心机，正确放置十字轴和离心桶，在使用前检查离心管和盛放离心标本的容器是否破损，用于离心的试管和标本容器应当牢固盖紧，离心桶的装载、平衡必须在生物安全柜内进行，离心桶和十字轴按重量配对，并在装载离心管后正确平衡，离心管不能装得过满，液面距离心管口留出一定空间，否则会导致漏液，空离心管用蒸馏水来平衡，每次使用后，要用75％酒精清除离心桶、转子和离心机腔的污染，每天检查离心机转子部位的腔壁是否被污染或弄脏，离心转子和离心桶是否有腐蚀或细微裂痕。一、微生物实验室生物安全管理（三）实验室设备和仪器

3.组织研磨器戴上手套并用含75％酒精的纱布包住玻璃研磨器，在生物安全柜内进行组织研磨器的打开和操作。4.冰箱与冰柜的维护和使用冰箱和低温冰箱通常每半年除霜和清洁，如有特殊情况应立即除霜和清理，清理出在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护。储存在冰箱内的所有容器清楚地标明内装物品的名称、储存日期和储存者的姓名，未标明的或废旧物品应高压灭菌后丢弃。由微生物室负责人保存一份冻存物品的清单。冰箱内不能放置易燃溶液。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

1.生物危害物的溢出处理（1）在生物安全柜以外潜在危害性气溶胶的释放时，所有人员必须立即撤离相关区域，立即报告部门负责人，为了使气溶胶排出和使较大的粒子沉降，在1h内严禁人员入内，门口张贴“禁止进入”的标志，过了相应时间后，在生物安全负责人的指导下来清除污染。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

生物危害物溢出清除程序：1）戴手套、口罩，穿防护服，必要时进行脸和眼睛防护。2）用布覆盖并吸收溢出物。3）向布上倾倒消毒剂，并覆盖周围区域。4）使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。5）作用30-60min后，将布以及污染材料清理掉。如果含有碎玻璃或其他锐器，玻璃碎片应用镊子清理，使用簸箕来收集处理过的物品，并将它们置于锐器盒中以待处理。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

生物危害物溢出清除程序：6）再次用消毒剂擦拭污染区域（如有必要，重复第2～5步）。7）污染材料及用于清理的布和抹布放入感染性废物袋内。8）如果用簸箕清理破碎物，应当将其放在消毒液内浸泡。9）如果实验表格或其他打印或手写材料被污染，应将这些信息复制，并将原件置于感染性废物袋内。10）在成功消毒后，报告部门负责人目前溢出区域的清除污染工作已经完成。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

1.生物危害物的溢出处理（2）在生物安全柜内潜在危害性气溶胶的释放时：1）在安全柜处于工作状态下立即进行清理。2）使用爱尔施消毒剂（1000ml/6片），并在处理过程中尽可能减少气溶胶的生成，作用30~60min，再用水擦拭干净。3）所有接触溢出物品的材料都要用75%酒精消毒或高压灭菌。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

1.生物危害物的溢出处理（3）未装可封闭离心桶的离心机内盛有潜在感染性物质的离心管发生破裂时：1）关闭机器电源，让机器密闭30min使气溶胶沉积。2）通知生物安全负责人。3）戴厚橡胶手套操作。4）破碎的离心管、离心桶、十字轴和转子都放在75%酒精内。5）未破损的带盖离心管应放在另一个有75%酒精的容器中，然后回收。6）离心机内腔用75%酒精擦拭。7）清理时所使用的全部材料都按感染性废弃物处理，放入感染性废物袋内。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

2.刺伤、切割伤或擦伤（1）受伤人员用流水清洗双手和受伤部位。（2）使用碘伏进行皮肤消毒，必要时去门急诊进行相应处理。（3）记录受伤原因和相关的微生物，并应保留完整的医疗记录。一、微生物实验室生物安全管理（四）实验室意外事件或事故处理

3.经胃肠道摄入潜在感染性物质（1）受害人脱下防护服。（2）去医院门急诊进行相应的处理。（3）报告摄入材料的鉴定和事故发生的细节，并保留完整的医疗记录。一、微生物实验室生物安全管理（五）废弃物的处理

1.培养基、组织、体液等废弃物处理（1）放在感染性废物袋内储存、运输及消毒灭菌。（2）在丢弃之前高压灭菌消毒。（3）高压灭菌后由暂存点工作人员回收至医院废物集中储存点。（4）运送前必须检查医疗废物收集袋或容器封口是否严密，是否破损、泄漏，如有破损、泄漏应加套防漏感染性废物袋确保运送途中安全。（5）运输推车采用爱尔施擦拭消毒，上、下午工作结束后各一次。一、微生物实验室生物安全管理（五）废弃物的处理

2.锐器盒处理（1）锐器盒采用有资质的厂家所生产的标准利器盒。（2）锐器盒盛装废物3/4时即封口。（3）由暂存点工作人员回收至废物集中储存点。二、微生物检验的质量保证综合技能训练

实验室生物安全与质量控制二、微生物检验的质量保证（一）质量保证的基本要求

1.质量衡量方法按照目前临床细菌实验室的工作内容大致可分为三类,衡量其质量的技术指标不完全相同。第一类是检出细菌的实验，包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代医院发生细菌感染有时一份标本中会有两种以上细菌存在。无论标本直接涂片检查还是分离培养，检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量，应该用细菌检出率来衡量。二、微生物检验的质量保证（一）质量保证的基本要求

1.质量衡量方法第二类是鉴定细菌的实验，通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。目前，已知与人类感染有关的细菌有上千种，常规实验室经常可以分离到的也有几十种。能否对分离到的病原菌都做出准确的鉴定，是反映实验室工作质量的一个重要方面，例如将细菌鉴定到种的准确率，作为衡量鉴定工作质量的指标。第三类是药敏试验，有稀释法和纸片法两种试验。稀释法药敏试验是定量的实验，可以用准确度和精密度来衡量质量。纸片法药敏试验以敏感或耐药的形式报告结果，属于定性的实验，但实验过程中测量抑菌环直径是定量的指标，应该使用准确度和精密度衡量其质量，以保证纸片法药敏试验的质量。二、微生物检验的质量保证（一）质量保证的基本要求

2.质量保证工作的指导思想

质量保证工作必须贯穿于实验室工作的整个过程，包括分析前（标本的正确采集、运送等）、分析中（培养、分离、鉴定和药敏试验等）和分析后（结果报告、解释、临床反馈等）的质量管理。临床微生物实验室应该依据国家规定和自身特点建立质量管理体系，对实验室的一切活动进行全程监控和管理。实验室质量管理体系强调以服务对象（医生和患者等）为焦点，认真听取抱怨，及时收集反馈，及时发现问题，及时处理和纠正，做到质量的持续改进。二、微生物检验的质量保证（一）质量保证的基本要求

3.质量保证的智力因素

质量意识的深层次含义是观念和文化，人员素质对于实验室质量起关健作用。实验室应充分重视培养工作人员文化修养、服务意识和敬业精神，倡导以人为本，树立质量意识和法治意识。临床微生物工作人员应知晓实验室质量管理的有关规定，熟悉质量管理流程，并严格遵照执行。同时，应注重专业知识更新，使实验室人员能跟上技术发展的步伐，及时了解、掌握和运用临床微生物领域新知识、新技术，促进质量的改进。实验室应制定在职人员的继续教育计划付诸实施。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

1.质控物和质量控制标准建立质量控制系统，首先涉及质控物和质量控制标准，两者是质量控制的重要组成部分。（1）质控物质控物一般是指已知的被测样品。细菌学实验，质控物就是特定的细菌菌株，称为参考菌株。无论是定性还是定量实验，质量的监测点需设在一个敏感的位置。这个敏感点，对于定性实验，应在较弱阳性的范围内；对于定量实验，应该位于解释实验结果的临床决定性水平附近。用于质量控制的参考菌株见表综-2。菌种来自美国典型菌种保藏中心（ATCC）或英国国家典型菌种保藏中心（NCTC）。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

菌株NCTCATCC

菌株NCTCATCC培养基用

培养基用

醋酸钙不动杆菌杆菌784415308

无乳链球菌818113813嗜水气单胞菌78109071

肺炎链球菌746510015产气肠杆菌1000613048

副溶血性弧菌1090317802阴沟肠杆菌1000513047

药敏试验用

粪肠球菌8213

金黄色葡萄球菌

25923大肠埃希菌900111775

金黄色葡萄球菌

29213肺炎克雷伯菌41815380

大肠埃希菌

25922普通变形杆菌417513315

大肠埃希菌

35218雷极普罗威登斯菌7475

铜绿假单胞菌

27853黏质沙雷菌11935

粪肠球菌

29212迟缓爱德华菌11934

淋病奈瑟菌

49226鼠伤寒沙门菌7413311

流感嗜血杆菌

49247金黄色葡萄球菌853212600

肺炎链球菌

49619铜绿假单胞菌72447700

肺炎克雷伯菌

700603质量控制用参考菌种二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

1.质控物和质量控制标准（2）质量控制标准

1）培养基的质量控制标准。培养基的质量控制指标是定性的，一般以细菌能否在培养基中生长或能否形成典型菌落来衡量。基础培养基不仅要求细菌能够生长，而且必须发育良好，并能使细菌充分表现出其典型的特征，如典型菌落形态、溶血特征等。有些基础培养基应满足营养要求高的细菌生长，评定其质量须用灵敏的菌种。选择性培养基必须包括应抑制的菌种和应被选择生长的菌种。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

培养基a控制方法菌种结果生长抑制反应叠氮钠血琼脂XX

化脓性链球菌小菌落

乙型溶血

大肠埃希菌生长抑制血琼脂X

化脓性链球菌小菌落

乙型溶血

肺炎链球菌中等菌落脑心浸出液X

金黄色葡萄球菌24h生长巧克力琼脂X

流感嗜血杆菌24h生长营养琼脂X

金黄色葡萄球菌生长中国蓝蔷薇酸琼脂

XX大肠埃希菌蓝色菌落

宋内志贺菌无色菌落麦康凯琼脂

XX金黄色葡萄球菌不生长

大肠埃希菌粉红色菌落

奇异变形杆菌无色菌落SS琼脂

XX金黄色葡萄球菌不生长

产气肠杆菌粉红色菌落

鼠伤寒沙门菌中心黑色

无色菌落常用培养基的质量控制标准二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

生化反应NCTC菌株阳性阴性靛基质雷极普罗威登斯菌黏质沙雷菌M-R雷极普罗威登斯菌阴沟肠杆菌V-P黏质沙雷菌雷极普罗威登斯菌枸橼酸盐雷极普罗威登斯菌迟缓爱德华菌精氨酸双水解酶阴沟肠杆菌雷极普罗威登斯菌鸟氨酸脱氢酶黏质沙雷菌雷极普罗威登斯菌DNA酶黏质沙雷菌雷极普罗威登斯菌葡萄糖盐酸阴沟肠杆菌雷极普罗威登斯菌H2S（TSI）迟缓爱德华菌雷极普罗威登斯菌ONPG黏质沙雷菌雷极普罗威登斯菌苯丙氨酸脱氢酶雷极普罗威登斯菌阴沟肠杆菌尿素酶雷极普罗威登斯菌黏质沙雷菌葡萄糖产气阴沟肠杆菌雷极普罗威登斯菌常用生化反应培养基质量控制标准二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

（2）质量控制标准

2）药敏试验质量控制标准琼脂扩散法药敏试验为直接测定抑菌环直径。因为其属于定量测定，以数理统计的方法确定其质量控制标准。参考菌株分别选择了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，以分别代表临床上常见的革兰阳性球菌、肠杆菌和非发酵菌。参考菌株的抑菌环质量控制标准：药物对该菌株的抑菌环直径平均值±2标准差。为了简明起见，将这个指标换算成抑菌环直径质量控制允许范围。常用药物的质量控制标准见相关章节。实验室进行室内质量监测，连续30次监测的结果只允许最多3次超过质量控制范围，并且这3次失控不应该连续出现。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

（2）质量控制标准

2）药敏试验质量控制标准

稀释法药敏试验是定量的测定，质量控制标准是参考菌株的MIC值。选择适当的参考菌株很重要，关系到能否起到质量控制作用。有连续10个梯度药物浓度的试验，参考菌株的MIC值须位于第3-7个浓度之间。如果实验仅有3个浓度，必须选两个参考菌株，一株的MIC位于高浓度，另一株的MIC是位于低浓度。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

（2）质量控制标准

3）仪器设备的质量控制标准。细菌实验室使用的仪器设备主要有孵箱、冰箱、冰柜、高压灭菌器、二氧化碳培养箱、厌氧培养箱等。绝大多数设备都是长期运转，对质量的要求是必须保持在运行过程中能维持技术指标的稳定，并要求定期维护。控制温度在整个细菌实验中很重要，控温设备在不间断的工作情况下难免受电压波动、老化等影响而发生变化。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

仪器设备质量控制标准设备控制标准允许范围高压灭菌器121℃≥121℃孵育箱35℃±1℃水温箱37℃±1℃冰箱4℃±2℃低温冰箱-20℃±5℃CO2温箱5%-10%＜10%二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

2.质量监测室内质量控制的重要内容是对各种实验条件及实验过程进行监测。监测对象主要有仪器设备、培养基及操作全过程。（1）高压灭菌器：须定期检查灭菌器的灭菌效果，至少每月1次。测试方法可用留点温度计或嗜热脂肪芽孢杆菌等，并定期维修。（2）温箱、冰箱：每日工作开始，打开冰箱或温箱等控温设备前，及下午下班前需观察当时设备的指示温度并及时记录。有条件的实验室最好进行24小时温度监控。（3）厌氧设备：用美蓝或刃天青指示剂作厌氧环境的指示系统，每次制备厌氧环境，均须设指示系统。记录每次结果。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

2.质量监测（4）CO2设备：使用CO2培养箱时，须在每天打开培养箱前观察向内CO2浓度的指示并及时记录。（5）培养基：每批新购置或新配制的培养基，用前应用质量控制的参考菌株测试其效果。干燥培养基用前应了解其失效期限及有无潮解。培养基的PH非常重要，新购商品干燥培养基在用前须检查培养基的PH，并做必要的校正，加以记录。二、微生物检验的质量保证（二）室内质量控制

2.质量监测（6）试剂：如氧化酶试剂、触酶试剂，每天用前须以阳性菌株测试。革兰染色用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌制备浓菌悬液，经高压灭菌后冰箱保存，此悬液作为革兰染色的质量控制，每次控制与标本同步进行。诊断血清须定期用已知参考菌株做测试。（7）药敏试验：现行的质量控制方法是在连续监控测定试验达到稳定的状态后，每周做1-2次监测，并绘制质控图。在连续的监控测试中，每30次中，如果连续两次出现超过允许范围，必须改为每日监测，并寻找失控的原因，进行必要的纠正。二、微生物检验的质量保证（三）室间质量评价

1.用模拟临床标本做质量评价为目前国内外广泛采用的方法，主要评价实验室在病原菌的分离、鉴定和