微生物学检验技术 课件 28项目二十八：病原性真菌鉴定

项目二十八病原性真菌鉴定学习目标1．掌握菌丝、孢子的概念；单细胞真菌和多细胞真菌的形态结构特点；真菌的检验方法；毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子癣菌属的主要生物学特性和微生物学检验；白假丝酵母菌、新型隐球菌的生物学特性、微生物学检验及鉴定依据。2．熟悉菌孢子和细菌芽胞的不同；真菌标本采集注意事项；真菌的鉴定程序及药敏试验；浅部感染真菌、深部感染真菌的临床意义；曲霉的生物学特性和微生物学检验。3．了解真菌的抵抗力；与疾病、实验室生物安全的关系；其他真菌的生物学特性和微生物学检验。4．具有正确采集和处理常见病原性真菌检验标本及进行相关检测的能力。5．能正确选择试验项目对常见病原性真菌进行检验，能正确判断和分析试验结果并发出检验报告。项目二十八病原性真菌鉴定思维导图项目二十八病原性真菌鉴定一、真菌基本性状一、真菌基本性状概述真菌（fungus）属于真核细胞型微生物，具有典型细胞核和完整细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素。细胞壁含几丁质和纤维素，不含肽聚糖。分为单细胞和多细胞两类，它们为异养生物。真菌广泛分布于自然界，种类繁多，有10万余种。大多数真菌对人类有益，应用于酿酒、制酱、抗生素生产等领域。只有少数可对人和动物致病，主要引发人类感染性、中毒性或超敏反应性疾病。）（一）形态与结构一、真菌基本性状单细胞真菌圆形或卵圆形，称为酵母菌或类酵母菌。多以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成新的独立个体。对人致病的的主要有白色念珠菌和新型隐球菌。类酵母菌—白假丝酵母菌芽生孢子假菌丝酵母菌（孢子，无菌丝）一、真菌基本性状（一）形态与结构多细胞真菌（又称丝状真菌或霉菌）由菌丝和孢子组成，菌丝伸长分支，交织成团。菌丝和孢子，形态因菌种不同而异，是鉴别真菌的重要标志。多细胞真菌形态一、真菌基本性状（一）形态与结构菌丝形态孢子形态一、真菌基本性状（一）形态与结构大分生孢子的形态芽生孢子厚膜孢子一、真菌基本性状（一）形态与结构关节孢子孢子囊孢子一、真菌基本性状（一）形态与结构区别点真菌孢子细菌芽胞大小较大较小形态与位置多样，可在细胞内和细胞外形成圆形或卵圆形，只在细胞内形成数目一条菌丝可产生多个孢子一个细菌体只能形成一个芽胞对热抵抗力不强，60-70℃短时间即可被杀死强，耐高温，短时间内煮沸不被杀死作用真菌繁殖方式之一细菌休眠状态真菌孢子与细菌芽胞的区别一、真菌基本性状（一）形态与结构另有一些真菌因寄生环境及营养、温度、氧气等培养条件的不同，可交替出现两种形态，即在室温中呈丝状真菌型，而在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以被称为双态真菌或二相真菌。一、真菌基本性状（二）真菌的繁殖1.无性繁殖：致病性真菌多是无性繁殖

真菌的无性繁殖方式主要有以下几种形式：①出芽繁殖：酵母菌属②芽管繁殖：大多数真菌③分裂繁殖：裂殖酵母菌④生隔繁殖2.有性繁殖

有性繁殖过程一般包括下列三个阶段：①质配②核配③减数分裂一、真菌基本性状（三）真菌的抵抗力1.物理因素对热抵抗力不强，一般加热60～70℃短时间内即可杀死真菌。真菌的孢子或菌丝暴露于紫外线下，均能被迅速杀死。2.化学因素对2.5%碘酊、0.1%升汞、2%石炭酸、及10%甲醛均较敏感。某些染色剂对若干真菌生长也有抑制作用3.抗生素真菌对常规抗生素均不敏感。抗真菌药物，如灰黄霉素、两性霉素B、克霉素、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶等对多种真菌有抑制作用。黄柏、紫草、土槿皮等中药对真菌有抑制作用。一、真菌基本性状（四）真菌与人类疾病1.病原性真菌感染2.条件致病性真菌感染3.超敏反应性疾病4.真菌性中毒症5.真菌毒素与肿瘤一、真菌基本性状（五）真菌与实验室生物安全鉴于真菌的特殊性，在进行真菌检验时注意事项为：①真菌的分离培养和鉴定等实验操作应在生物安全柜中进行，尤其是粗球孢子菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、新型隐球菌等。②每天工作前后应对工作区域进行消毒灭菌，废弃培养物及真菌污染的物品在清洗或丢弃前，必须经高压灭菌或焚烧。③为了避免孢子感染，不可试着闻平板上培养物产生的气味。④不可对组织胞浆菌、球孢子菌等进行玻片培养，以免其孢子在空气中播散。二、真菌检测技术项目二十八病原性真菌鉴定二、真菌检测技术概述真菌的检测技术主要包括形态学检查、分离培养、生化反应、免疫检测、核酸检测等，其中最为常用的是直接镜检和分离培养鉴定技术。二、真菌检测技术（一）标本的采集和鉴定程序■采集标本注意事项1.标本来源要适宜2.用药前采集标本3.采集的标本量要充足4.严格无菌操作5.采集的标本立即送检。不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。最长不超过2h血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份■根据真菌感染部位采集不同的标本。浅部真菌感染---毛发、皮屑、指（趾）甲等深部真菌感染---痰液、脓汁、血液、脑脊液等二、真菌检测技术（一）标本的采集和鉴定程序真菌的鉴定程序二、真菌检测技术（二）直接检查■直接镜检直接镜检是实验室最简单最有用的诊断方法,标本不需染色,直接镜下观察。镜检若发现有真菌菌丝或孢子存在时,可初步判定为真菌感染,但不能确定到种,需要做进一步的检验。■染色镜检在载玻片上滴1滴生理盐水,将所采集的标本均匀涂在载玻片上,自然干燥后,火焰或甲醇固定。选择适当的染色方法,染色后以高倍镜或油镜观察。二、真菌检测技术（二）直接检查1.革兰染色

所有真菌均为革兰染色阳性,被染成深紫色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌的检测。2.乳酸酚棉蓝染色用于各种真菌培养物的镜检,被染成蓝色。3.墨汁负染色用于检测脑脊液中的新型隐球菌。背景染成黑色,菌体不着色,在黑色背景下,可见球形透亮菌体外有折光性强的宽厚荚膜。4.荧光染色通常有三种方法,即直接涂片、培养涂片和组织切片染色。5.瑞氏染色用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。6.过碘酸希夫染色用于体液渗出液和组织匀浆等染色。真菌胞壁中的多糖染色后呈红色,组织内的糖原成分亦应染成红色,但经淀粉酶消化后消失。7.嗜银染色真菌可染成黑色,主要用于检测组织内真菌。常用染色方法有七种二、真菌检测技术（三）分离培养真菌培养基及作用培养基名称作用沙保弱培养基真菌的常规培养放线菌酮-氯霉素琼脂真菌的常规培养心脑浸液葡萄糖血琼脂深部真菌培养玉米粉吐温-80琼脂观察厚膜孢子（白假丝酵母菌）马铃薯葡萄糖琼脂观察真菌菌落色素尿素琼脂生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）真菌营养要求不高，在一般细菌培养基上即可生长。最适pH4.0～6.0。在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以在沙保罗培养基上的生长现象来描述真菌菌落形态。二、真菌检测技术（三）分离培养

(1)生长速度:缓慢生长菌:7~14天;快速生长菌:2~7天。一般浅部真菌超过2周,深部真菌超过4周仍无生长,可报告阴性。(2)表面形态:扁平、凸起或凹陷、皱褶等。(3)大小:菌落大小用厘米来表示,菌落大小与生长速度和培养时间有关。(4)菌落质地:平滑状、粉状、粒状、棉花状、粗毛状、皮革状、黏液状、膜状。(5)菌落颜色:不同的菌种表现出不同的顔色。致病性真菌的颜色多较淡,呈白色或淡黄色,而且其培养基也可变色,如马尔尼菲青霉等。有些真菌菌落不但正面有颜色,其背面也有深浅不同的顔色。菌落的颜色与培养基种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。(6)菌落的边缘:有些菌落的边缘整齐,有些不整齐。观察指标二、真菌检测技术（四）真菌的鉴定KOH透明法标本（脓、痰、尿、粪）皮屑等血、脑脊液沙保弱培养基、BA增菌培养鉴定：形态染色生长现象生化反应形态结构结果初报结果报告二、真菌检测技术（五）真菌的药敏试验按美国国家临床实验室标准化委员会标准，抗真菌药物敏感性试验常用肉汤稀释法，包括常量稀释法和微量稀释法。根据化学结构分类多烯类：如两性霉素B、制霉菌素等。吡咯类：如酮康唑、伊曲康唑等。其他：如氟胞嘧啶。根据作用机制分类作用于真菌细胞膜：如两性霉素B等。作用于真菌细胞壁：如尼可霉素Z等。干扰真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等。其他：如大蒜新素及冰醋酸等三、常见病原性真菌鉴定项目二十八病原性真菌鉴定（一）浅部感染真菌1.皮肤癣真菌（1）生物学特性1）表皮癣菌属

镜下：棒状薄壁大分生孢子，有分隔；成熟

菌落中可见厚膜孢子菌落：SDA上菌落开始呈白色鹅毛状，后转

变为黄绿色粉末状絮状表皮癣菌大分生孢子、厚膜孢子及菌落（1）生物学特性2）毛癣菌属

镜下：细长棒状薄壁的大分生孢子；葡萄状或梨状的小分生孢子；菌丝形态多样，呈

螺旋状、球拍状、鹿角状或结节状菌落：SDA上菌落呈绒毛状、粉末状或蜡状；菌落颜色为白色、红色、橙色、黄色、

奶油色及紫色等红色毛癣菌大分生孢子、小分生孢子及菌落（一）浅部感染真菌1.皮肤癣真菌（1）生物学特性3）小孢子菌属

镜下：厚壁梭形大分生孢子；卵圆形小分生孢子；

菌丝有隔，呈梳状、结节状和球拍状菌落：SDA上形成灰色、橘红色或棕黄色，绒毛状

或粉末状的菌落犬小孢子菌大分生孢子及菌落（一）浅部感染真菌1.皮肤癣真菌（2）微生物学检验1）标本采集皮屑、甲屑、病发2）检验方法①直接镜检：观察菌丝及孢子形态特征。②分离培养与鉴定：观察菌落特征及镜下结构，必要时做鉴定试验（毛发穿孔试验、脲酶试验和特殊营养需要试验）。（一）浅部感染真菌1.皮肤癣真菌1.白假丝酵母菌（1）生物学特性圆形或卵圆形，G+,以芽生孢子出芽繁殖，可形成假菌丝。在组织内易形成芽生孢子和假菌丝。在SDA上形成类酵母型菌落，在玉米培养基上可长出厚膜孢子。能同化多种糖，不能利用硝酸盐，尿素酶阴性。白假丝酵母菌厚膜孢子、假菌丝、芽生孢子及菌落（二）深部感染真菌（2）微生物学检验1）标本：分泌物、痰、尿、粪、血或脑脊液等2）检验方法及鉴定①直接镜检：G+，着色不均的圆形或卵圆形芽生孢子或有假菌丝。②分离培养：奶油色、类酵母型菌落，镜检可见芽生孢子和假菌丝。③鉴定实验：芽管形成试验、厚膜孢子形成试验、TTC试验、糖同化或发酵试验。④其他检测：抗原检测、抗体检测、G试验、核酸检测、动物试验。⑤药敏试验芽管形成试验厚膜孢子形成试验显色培养基（二）深部感染真菌1.白假丝酵母菌（1）生物学特性圆形或卵圆形，常采用墨汁负染色后镜检，有宽厚荚膜，以出芽方式繁殖。营养要求不高，在SDA上形成酵母型菌落，初为乳白色小菌落，渐转变为橘黄色，终为棕褐色。可分解尿素，能同化各种碳水化合物，但不发酵糖。新型隐球菌荚膜、孢子及菌落（二）深部感染真菌2.新型隐球菌（2）微生物学检验1）标本采集：脑脊液、痰液、尿液、脓汁、活体组织及尸体解剖材料等2）检验方法①直接镜检：革兰染色可见G+的球形或卵圆形孢子，墨汁负染色可见黑色背景下圆形孢子，周围有透光的厚荚膜。②分离培养：形成酵母型菌落，菌落初为白色、光滑、奶油样，渐变为淡褐色、黏液样。③鉴定试验：酚氧化酶试验、脲酶试验、糖同化及发酵试验。④其他检测：抗原检测、抗体检测、核酸检测、动物试验。⑤药敏试验（二）深部感染真菌2.新型隐球菌菌丝：有隔，多细胞性，有分枝；足细胞接触培养基的部分，厚壁而膨大分生孢子梗：从足细胞直立生长顶囊：孢子梗顶端膨大，半球形或椭圆形小梗：顶囊上，辐射状，一层或二层杆状分生孢子：小梗顶端，成串，球形，不同颜色分生孢子头：菊花样的头状结构，因菌种不同而呈不同颜色烟曲霉黄曲霉黑曲霉构巢曲霉土曲霉（二）深部感染真菌3.曲霉菌落：在沙保培养基上形成丝状菌落，由于产生分生孢子而渐呈现不同颜色烟曲霉菌落黄曲霉菌落黑曲霉菌落构巢曲霉菌落土曲霉菌落（二）深部感染真菌3.曲霉在沙保培养基上形成丝状菌落，镜下可见孢子囊梗、孢子囊、孢子囊孢子。引起毛霉病。毛霉菌落孢子囊与孢子囊孢子（二）深部感染真菌4.毛霉在沙保培养基上25℃培养形成丝状菌落，镜下可见特征性的齿轮状大分生孢子。荚膜组织胞浆菌菌落（25℃）荚膜组织胞浆菌大分生孢子（二）深部感染真菌5.荚膜组织胞浆菌姬姆萨染色，可见孢囊内的8个孢子；亚甲胺蓝染色，孢囊囊壁呈深褐色或黑色，孢子不着色。是条件致病菌，引起卡氏肺孢菌性肺炎。Giemsa染色，卡氏肺孢菌包囊亚甲胺兰染色，卡氏肺孢菌包囊（二）深部感染真菌6.卡氏肺孢子菌镜下可见透明、分隔菌丝，分生孢子梗光滑而无顶囊；帚状分枝，双轮生，散在，稍不对称，有2～7个散在、不平行的梗基，其上有2～6个瓶梗，顶端狭窄，可见单瓶梗，其顶