微生物学检验技术 课件 16项目十六：细菌生物化学试验

项目十六细菌生物化学试验思维导图项目十六细菌生物化学试验学习目标1．掌握细菌各种生化反应原理。2．熟悉个生化试验用于哪些菌间的鉴别。3．了解各生化反应所用的培养基。4．具有准确接种标本和分析实验反应的能力。5．能正确选择试验项目对常见菌进行检验，能正确判断和分析试验结果并发出检验报告。项目十六细菌生物化学试验一、碳水化合物的代谢试验项目十六细菌生物化学试验一、碳水化合物的代谢试验（一）糖（醇、苷）类发酵试验产酸(+)：丙酮酸、乳酸、细菌糖类产酸产气⊕：CO2、H2

不分解：(-)由于不同细菌菌体内的酶系统不同，故对糖类的代谢产物也不一样，可借此来鉴别细菌。酶方法：

在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。结果：

1.产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。2.产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“”表示。3.不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。应用：

是鉴别细菌最主要和最基本的试验，特别是肠杆菌科鉴定的主要试验。⊕一、碳水化合物的代谢试验（二）氧化/发酵试验原理：

分解—氧化型细菌，如微球菌、绿脓b

细菌

有O2或无O2分解—发酵型细菌，如葡萄c、肠杆菌科不分解—产碱型细菌，如莫拉莫拉菌

方法：

将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm)，35℃培养48h。有O2结果：应用：主要用于肠杆菌和非发酵菌的鉴别，也可用于葡萄球菌与微球菌的鉴别。原理：

甲基红试验简称为MR试验。细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等混合酸，使培养基pH下降至4.4以下，加入甲基红指示剂变为红色，为MR试验阳性。若细菌产酸量少或因酸进一步分解为其他物质（如醇、醛、酮等），使培养基pH在5.4以上，则甲基红指示剂呈黄色，为MR试验阴性。一、碳水化合物的代谢试验（三）甲基红试验应用：甲基红试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。原理：有些细菌在发酵葡萄糖产生丙酮酸后，能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基反应，生成红色化合物。若培养基中胍基含量较少，可加入少量含胍基的肌酸或肌酐等物质。试验时若加入α-荼酚，则可使该试验速度加快。一、碳水化合物的代谢试验（四）V-P试验

方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃培养18～24h后，按每毫升培养基加入含0.3％肌酸或肌酐的40％KOH溶液0.1ml，充分混匀后，观察结果，出现红色为V-P试验阳性。

应用：V-P试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。该试验可与甲基红试验联合使用，甲基红试验阳性的细菌，V-P试验通常为阴性。一、碳水化合物的代谢试验（五）β-半乳糖苷酶试验原理：

ONPG邻-硝基酚(黄色）+β-D-半乳糖方法：从KIA斜面上刮取菌苔，加入0.25ml无菌生理盐水制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，使β-半乳糖苷酶释放，置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴(35~37℃)20min~3h，观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性。应用：本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。水解β-半乳糖苷酶原理：七叶苷(esculin)+H2O七叶素+GS

黑色化合物方法：把待测菌接种于七叶苷培养基，35~37℃，18~24h。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于D群链球菌(+)与其它链球菌(-)的鉴别。也可用于革兰阴性菌(-)和厌氧菌(+)的鉴别。一、碳水化合物代谢试验（六）七叶苷水解试验七叶苷酶

细菌Fe2+(培养基中)二、蛋白质和氨基酸的代谢试验项目十六细菌生物化学试验原理：

某些细菌含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸产生靛基质（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛反应，生成红色的化合物。该试验也称为吲哚试验。方法：

将待检细菌接种到蛋白胨水中，35℃培养18～24h后，在培养基中加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛），试剂与培养基两液面接触处呈现红色为阳性，无色为阴性。应用：靛基质试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（一）靛基质试验原理：

有些细菌能分解培养基中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），产生H2S，H2S与培养基中Fe2+（或Pb2+）反应生成黑色的硫化亚铁或硫化铅。方法：

将待检细菌接种到含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基中，35℃培养18～24h后，呈现黑色沉淀者为阳性，无变化者为阴性。应用：硫化氢试验主要用于肠杆菌科菌属间的鉴定。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（二）硫化氢试验原理：

有些细菌能产生尿素酶，可分解尿素生成氨和CO2，氨在水溶液中形成碳酸铵，使培养基呈碱性。方法：

将待检菌接种于尿素培养基中，培养后出现红色为阳性，不变色为阴性。应用：

尿素酶试验主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定，亦可用于幽门螺杆菌等的鉴定。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（三）尿素酶试验原理：

某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与10％氯化铁作用形成绿色化合物。方法：将待检菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面上（接种量稍大），培养后在钭面上直接滴加4～5滴10％氯化铁试剂，出现绿色反应者为阳性。该试验亦可采用快速纸片法，即用1cm大小的滤纸片浸泡于10％苯丙氨酸磷酸盐缓冲液（pH7.2～7.4）中，晾干备用。将待检菌涂布在纸片上，35℃培养15min，取出后滴加10％氯化铁溶液，立即观察结果，绿色为阳性，无色为阴性。3.应用苯丙氨酸脱氨酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（四）苯丙氨酸脱氨酶试验二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（五）氨基酸脱羧酶试验原理：氨基酸胺+CO2，胺使培养基变碱，指示剂则变色。培养基：氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基。结果：对照管呈黄色，测定管呈紫色(溴甲酚紫为指示剂)为阳性，若测定管也为黄色为阴性。若对照管呈紫色则试验毫无价值，不能作出判定。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。特异脱羧酶三、碳源利用试验项目十六细菌生物化学试验原理三、碳源利用试验（一）枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH变碱性溴麝香草酚蓝呈碱性变色培养基变蓝培养基方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，培养后观察结果。培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性，培养基中无菌生长、仍为绿色者为阴性。应用：枸橼酸盐利用试验主要用于肠杆菌科细菌属间的鉴别。沙门菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属等通常为阳性，埃希菌属、志贺菌属等为阴性。原理：

某些细菌能将丙二酸盐分解成碳酸钠，使培养基变碱(原pH6.8→pH↑)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：丙二酸盐培养基结果：

培养基由淡绿变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。应用：

用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。三、碳源利用试验（二）丙二酸盐利用试验四、酶类试验项目十六细菌生物化学试验原理：

有的细菌具有触酶，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成氧分子出现气泡。方法：

取待检细菌少许，置于洁净的载玻片上，滴加3％H2O2试剂1～2滴，观察结果。一分钟内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。应用：

触酶试验常用于革兰阳性球菌的初步分类。葡萄球菌、微球菌触酶试验阳性，链球菌属触酶试验阴性。四、酶类试验（一）触酶（过氧化氢酶）试验原理：氧化酶+1%四甲基对苯二胺→红色的醌类化合物方法：①滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后滴加试剂。②试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸片上。③菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。结果：

10秒钟内呈深紫色为阳性。同时应以铜绿假单胞菌(+)与大肠埃希菌(-)做对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。四、酶类试验（二）氧化酶试验原理：致病性葡萄球菌→凝固酶→血浆中纤维蛋白原(液态)→

纤维蛋白(固态)→血浆凝固方法：①玻片法：检测结合凝固酶②试管法：检测游离凝固酶结果：阳性菌液聚集成团块或颗粒状应用：作为鉴别葡萄球菌致病性的重要指标。四、酶类试验（三）凝固酶试验10″四、酶类试验（四）DNA酶试验原理：

DNA寡核苷酸链→溶于盐酸→菌落周围形成透明环

培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：把被检菌点种于上述平板，35℃18~24h，加入1mol/LHCl→观察结果，同时设阳性和阴性对照。结果：菌落周围有透明环为(+)

菌落周围无透明环为(-)应用：可用于鉴别细菌：金黄色葡萄球菌为阳性，沙雷菌和变形杆菌也为阳性。DNA酶四、酶类试验（五）硝酸盐还原试验还原酶原理：硝酸盐亚硝酸盐+氨亚硝酸盐+试剂→颜色反应(红色)方法：

将待测菌接种于硝酸盐培养基中，35℃1~4天，加入0.1ml甲、乙等量混合液，摇匀，立即观察结果。应用：

广泛应用于细菌鉴定中。如肠杆菌科细菌均为阳性，铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌可产生氨(放入一倒管检测)，而韦荣球菌也为阳性。某些细菌原理：

B群链球菌能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌β溶血素的活性。因此，血平板上，在两菌（B群链球菌和金黄色葡萄球菌）交界处出现箭头状溶血区。方法：取一个血液琼脂平板，先用产生β-溶血素的金黄色葡萄球菌在平板中央划种一条直线，再将被检菌在距金黄色葡萄球菌3mm处垂直划一短线。设阴性和阳性对照。35℃培养18～24h后观察结果。在被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线之间有一个箭头状透明溶血区，即为CAMP试验阳性。无箭头状透明溶血区者为阴性。四、酶类试验（六）CAMP试验应用CAMP试验主要用于链球菌属的鉴定。五、其他试验项目十六细菌生物化学试验五、其他试验（一）明胶液化试验原理：是利用某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体这样的原理进行的试验方法。方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7d，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30min，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别，另外多数假单胞菌也能液化明胶。原理：

主要是用于区分革兰阴性细菌和易脱色的革兰阳性细菌。由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少于稀碱溶液内易于破裂，而释放出未断裂的DNA螺旋，使KOH菌悬液呈现粘性，可有搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌在稀碱溶液中仍保持不变。方法：取1滴4%KOH水溶液于洁净玻片上，用接种环于固体培养基上取新鲜配制菌落少许，于KOH溶液中搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出丝来。结果，能用接种环拉出丝来为阳性，仍为混悬液则为阴性。五、其他试验（二）拉丝试验应用：主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于5～10s内出现阳性反应,有的则需30～45s,假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性,不动杆菌、莫拉菌反应较慢,大多数菌株在60s内出现阳性,而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。六、复合生化试验项目十六细菌生物化学试验原理：

KIA琼脂中乳糖的浓度为葡萄糖的10倍，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，培养基中的葡萄糖被分解后只能产生少量的酸，在最初培养的8～11h内，这些酸也足以使培养基的底层和斜面变黄色。但连续培养数小时后，在细菌和氧的作用下，培养基的斜面所含氨基酸发生降解，释放氨类，立即中和斜面部分的酸，培养18～24h后，整个斜面转变成碱性，斜面又变成红色。培养基深层中，氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸，故仍呈黄色。因此KIA斜面呈碱性，深层呈酸性反应，说明该菌只分解葡萄糖而不分解乳糖。若细菌分解乳糖则产生大量的酸，这些酸能中和斜面产生的碱，使整个培养基呈黄色。若细菌能分解培养基中含硫氨基酸，则可产生H2S，H2S与培养基中枸橼酸铵铁起反应，产生不溶性的黑色硫化亚铁沉淀。六、复合生化试验（一）克氏双糖铁（KIA）试验方法：

用接种针挑取待检细菌，先穿刺接种到KIA深层，距管底3～5mm为宜，再从深层向上提起，在斜面上由下至上划线，35℃培养18～24小时，观察结果。常见的KIA反应结果有如下几种：①斜面碱性/底层碱性：不发酵糖类，如粪产碱杆菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌。③斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵，产生H2S。如沙门菌、普通变形杆菌。④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属。原理：动力靛基质尿素酶培养基中除含有200g/L尿素和酚红指示剂外，其蛋白胨较原克利斯顿森尿素培养基高10倍，并制成半固体培养基，以便观察细菌的动力。由于蛋白胨中含有丰富的色氨酸，产生色氨酸酶的细菌可以水解色氨酸形成靛基质，当加入靛基质试剂后形成玫瑰吲哚。产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产碱，使酚红指示剂显桃红色。因此，该试验可同时观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的情况。

六、复合生化试验（二）动力靛基质尿素酶（MIU）试验方法：