微生物学检验技术 课件 8项目八：染色标本检查

项目八染色标本检查学习目标1．掌握革兰染色和抗酸染色的原理、操作及结果判断。2．熟悉细菌染色标本检查的一般程序。3．了解特殊结构染色法和负染色法。4．能够正确使用光学显微镜油镜观察细菌。5．严格执行无菌操作，注意生物安全。项目八染色标本检查思维导图项目八染色标本检查一、染色标本检查的一般程序项目八染色标本检查只用一种染料对细菌进行染色的方法主要用于观察细菌的大小、形态和排列方式。常用的染料有亚甲蓝、结晶紫、石炭酸复红等碱性染料。染色方法为：细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片干燥后即可在显微镜下进行观察。一、染色标本检查的一般程序（一）单染色法（二）复染色法用两种或两种以上的染料对细菌进行染色的方法。既可以观察细菌的大小、形态与排列方式，又能鉴别细菌的染色性。最常用的是革兰染色法。细菌染色的一般程序：

涂片--干燥--固定--初染—媒染--脱色--复染一、染色标本检查的一般程序二、常用染色方法项目八染色标本检查细菌革兰染色是由丹麦病理学家ChristainGram于1884年创立的一种染色技术，后经学者改进一直沿用至今，是细菌检验平台经常使用而不可或缺的检验技术之一。通过革兰染色可以将细菌分为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-），不仅为分类鉴定提供依据，而且能够指导临床用药。二、常用染色方法（一）革兰染色法渗透学说G+菌细胞壁结构致密，脂类含量少G-菌细胞壁较疏松，脂类物质多化学学说G+菌细胞内含大量核糖核酸镁盐G-菌含核糖核酸镁盐少等电点学说G+菌等电点低，pH2-3G-菌等电点高，pH4-5二、常用染色方法（一）革兰染色法1.革兰染色原理结晶紫染液1卢戈氏碘液295%酒精3稀释石炭酸复红4二、常用染色方法（一）革兰染色法2.革兰染液配置结晶紫10g95%酒精100mlA液草酸铵1g蒸馏水100mlB液结晶紫乙醇饱和溶液100ml1%草酸铵水溶液100mlA液20mlB液80ml结晶紫染液100ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（1）结晶紫染液碘化钾2g蒸馏水100ml碘化钾水溶液100ml碘1g蒸馏水200ml卢戈氏碘液300ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（2）卢戈碘液95%酒精

直接购买成品，不需要配制二、常用染色方法（一）革兰染色法（3）脱色液碱性复红乙醇饱和溶液100ml取饱和液10ml稀释石炭酸复红染液100ml碱性复红1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml蒸馏水90ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（4）稀释石炭酸复红染液制片涂片干燥固定染色初染酶染脱色复染镜检油镜观察二、常用染色方法（一）革兰染色法3.革兰染色操作步骤初染（1min）媒染（1min）脱色（30-60s）复染（1min）吸去残水晾干水洗水洗水洗水洗二、常用染色方法（一）革兰染色法二、常用染色方法（一）革兰染色法4.革兰染色注意事项在进行革兰染色时特别要注意酒精脱色这一步，把握好脱色的时间。严格把握被检菌的培养时间，避免出现错误的染色结果。水洗时要用细流水冲洗。革兰染色时涂片不宜太厚也不宜太薄。控制好每一步染色的时间。革兰阳性球菌革兰阴性杆菌二、常用染色方法（一）革兰染色法5.革兰染色结果6.革兰染色实际意义鉴别细菌指导选择药物分析致病性二、常用染色方法（二）抗酸染色法分枝杆菌属的细菌，如结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，细胞壁中含有大量类脂（如分枝菌酸），使菌体不易着色，一般不用革兰氏染色。抗酸染色法是特异性地针对分枝杆菌属细菌的鉴别染色法。抗酸染色阳性的细菌称为抗酸杆菌。

分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色。细胞成分二、常用染色方法（二）抗酸染色法1.抗酸染色原理

分枝杆菌一般不易着色，要经过加热或者延长染色时间来促使其与石炭酸复红染液结合而着色。着色特点

分枝杆菌细胞结构中的分枝菌酸与染料结合牢固，一旦结合以后，就很难被酸性脱色剂脱色。难以脱色二、常用染色方法（二）抗酸染色法2.结果判断和报告结核杆菌染成红色，细长、直的或微弯曲杆菌，偶尔有杆菌着色不均，呈颗粒状者。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野，直到整个涂片找不到结核杆菌时，方可报告“未找到结核杆菌”。石炭酸复红染液13%盐酸酒精2碱性美蓝染液3二、常用染色方法（二）抗酸染色法3.萋－尼抗酸染色液的配制碱性复红乙醇饱和溶液100ml取饱和液10ml石炭酸复红染液100ml碱性复红1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml5%石炭酸90ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）石炭酸复红液浓盐酸3ml95%乙醇97ml3%盐酸酒精100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）3%盐酸酒精液美蓝酒精饱和溶液100ml取饱和液30ml美蓝染液130ml美蓝2g95%酒精100ml0.01%KOH100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）吕氏美蓝染色液厚涂片取标本在干净的载玻片上涂片，制成20mm×15mm大小的厚膜涂片。干燥自然干燥，让玻片上的水分挥发。固定玻片在酒精灯火焰外焰，以钟摆的速度通过火焰三次固定。二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）制片4.抗酸染色操作步骤初染石炭酸复红，冷染或热染脱色3%盐酸酒精复染碱性美蓝二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）染色二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）镜检二、常用染色方法（二）抗酸染色法每张载玻片只允许涂1份标本，不得涂2份或2份以上标本，以免染色过程中菌体脱落而导致阴阳结果混淆。抗酸染色的涂片要略厚，加温时随时补加染色液。抗酸染色时，脱色剂脱色时间宁长勿短。注意生物安全。5.抗酸染色注意事项临床意义鉴别细菌确定分枝杆菌感染程度判定分枝杆菌感染预后二、常用染色方法（二）抗酸染色法6.抗酸染色意义三、其他染色方法项目八染色标本检查三、其他染色方法（一）特殊染色法石炭酸复红法制片后滴加石炭酸复红染液，小火加热染料出现蒸汽约5分钟，冷后冲洗，用95%乙醇脱色2分钟，水洗，碱性亚甲蓝复染半分钟，水洗待干后镜检。芽胞呈红色，菌体呈蓝色。孔雀绿法制片后滴加5%孔雀绿，小火加热染料出现蒸汽15～20分钟，冷后冲洗，直至流出的水中无染色液为止，0.5%石炭酸复红复染5分钟，水洗待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。注意生物安全。1.芽胞染色三、其他染色方法（一）特殊染色法将新载玻片浸泡在95%的乙醇中，临用时取出用干净纱布擦干，滴1滴蒸馏水于玻片中央，用接种环挑取少许菌落点在蒸馏水滴顶部，置35℃孵箱自然干燥，滴加鞭毛染液染色1～2分钟，轻轻水洗（切勿用力太猛），自然干燥后镜检。鞭毛和菌体呈红紫色。2.鞭毛染色三、其他染色方法（一）特殊染色法制片后滴加结晶紫染液，在酒精灯上稍微加热至出现蒸汽为止，用200g/L的硫酸铜溶液冲洗染液（切勿用水洗），吸水纸吸干后镜检。菌体及背景呈紫色，菌体周围有一圈未着色的透明带。3.荚膜染色三、其他染色方法（一）特殊染色法4.异染颗粒染色制片后滴加A液（甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液）3～5分钟后水洗，滴加B液（碘化钾溶液）1分钟后水洗吸干镜检。菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。三、其他染色方法（二）负染色法背景着色而菌体本身不着色的染色方法。实际工作中常用墨汁复染色法来观察真菌及细菌荚膜。如新生隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。三、其他染色方法（三）荧光染色法荧光染色是用能够发荧光的物质对标本进行染色，在荧光显微镜下发出荧光。目前主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等病原菌的检测。如痰标本经金胺O染色后，在荧光显微镜下观察到金黄色荧光菌体。在普通光学显微镜下，可清楚地观察染色标本中细菌的形态和特殊结构，并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。用于细菌的染料主要有碱性和酸性两大类，细菌易与带正电荷的碱性染料结合，常用的碱性染料主要有碱性复红、结晶紫、美蓝等。细菌染色是常用的细菌形态检查法，分为单