荧光免疫技术（免疫学检验课件）

荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光检测技术的敏感性和直观性相结合而建立的一种标记免疫技术。前言常用的荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490nm-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术碘化丙啶（PI）488nm620nm橙红色Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光抗体的制备荧光素搅拌法透析法制备免疫血清亲和层析离子交换层析法纯化抗体标记抗体纯化透析法凝胶过滤法鉴定实际应用第二节荧光免疫显微技术

定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定

荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。

AbF+Ag（组织/细胞）AbF-Ag检测特异性荧光紫外线一、基本原理二、方法类型1.直接法2.间接法3.双标记法固定Ag（待测）＋Ab*——AgAb*快，直接、干扰因素少；常用于检测Ag

特异性高但敏感度偏低检测一种Ag，需标记一种Ab，较麻烦Ag？

AbF直接法制备一种荧光抗体，可检测多种Ag或Ab既可检测Ag，又可检测Ab。灵敏度高间接法荧光素标记抗抗体AgAb抗－Ab*双标记法两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一标本不同抗原表位反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。如：具CD3、CD4表位的Th细胞。ThCD3CD4（FITC黄绿）（RB200橘红）三、关键技术1.标本制作2.荧光抗体染色3.荧光显微镜检查4.荧光抗体染色结果判读标本制作组织切片：冷冻切片、石蜡切片印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃荧光抗体染色于已固定的标本上滴加相关试剂（含适当稀释的荧光抗体），置湿盒内25℃～37℃温育30分钟左右或4℃过夜；然后用PBS充分洗涤，待干燥后镜检。荧光显微镜检查（荧光显微镜）

光源：高压汞灯氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野相差聚光器镜头：消色差镜头隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，使紫外线（激发光）透过。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜的基本结构透射光：照明光线从标本下方经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上方落射到标本上，经反射进入物镜。透射荧光光路(a)落射荧光光路(b)荧光显微镜光路图光路荧光显微镜的基本结构设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型三、荧光抗体染色及结果判断荧光显微镜检查（结果判断）

“-”：无或极微弱“+”：较弱但清晰可见“++”：明亮“+++”：耀眼对照光：“-”或“±”阳性：特异荧光强度“+”以上效价：呈"+"的血清最高稀释度四、方法评价与应用方法评价优点：可用于抗原或抗体的定位、定性检查，既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。缺点：荧光容易消退，难以制备永久性标本，非特异荧光常干扰结果判断。第四节应用自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、荧光抗体技术的应用临床应用病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）荧光抗体技术的应用细菌（藤黄微球菌)荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。荧光抗体技术的应用细胞表面抗原和受体检测其他：如免疫病理、肿瘤等检测肿瘤抗原（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用第三节时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

时间分辨荧光免疫检测系统时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨技术相结合而建立的一种新型超微量物质免疫分析方法，具有灵敏度高、特异性强、发光稳定、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等特点，已在临床实验中广泛应用。AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab检测一、基本原理AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag

荧光寿命长：10μs-1000μs，时间差—

时间分辨

Stokes位移大：270nm，易分辨时间分辨短寿命荧光长寿命荧光Eu3+元素的stokes位移二、方法类型12

3双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法Eu增强液激发Eu固相Ab待检AgEu标记Ab每一步均需洗涤Eu解离发光双抗体夹心法增强液激发固相AbAg？AgEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗体竞争法增强液激发固相AgAg？AbEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗原竞争法三、方法评价

灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级

标记物稳定：有效使用期长

测量快速，易自动化易受污染，本底增高四、临床应用广泛用于微量或超微量物质的检测，如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物及病毒抗原等的测定。第四节荧光偏振免疫测定（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）

荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定液体中小分子物质的含量。荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出单一平面的偏振荧光的现象。一、基本原理

荧光物质经激发光照射后，可发出偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关荧光素标记的小分子抗原（AgF）偏振荧光弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振荧光强反应体系中待测Ag与AgF竞争结合已知抗体，故待测Ag越多，形成AgF-Ab越少，游离AgF多，故待检Ag含量与偏振荧光强度成反比

（一）FPIA原理荧光偏振免疫测定示意图二、方法评价荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测仪器设备昂贵，试剂盒专属性强灵敏度较非均相荧光免疫测定法低三、临床应用主要用于测定小分子抗原物质，是临床药物浓度测定的首选方法，目前已有多种药物、激素、毒品和常规生化项目可以用本方法进行分析，如环孢素、苯妥英钠、卡马西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、氨茶碱及鸦片浓度等测定。第五节免疫芯片技术（immunochip）

也称抗体芯片，属于蛋白质芯片的一种，是将抗原抗体结合反应的特异性与电子芯片高密度集成原理相结合而建立的一种全新概念的生物芯片检测技术。一、基本原理免疫芯片是将几个、几十个，甚至几万个或更多数量的抗原（或抗体）高密度排列在固相载体上，形成高密度抗原或抗体的微点阵。与患者的少量待检样品或生物标本同时进行特异性免疫反应，可一次获得芯片中所有已知抗原（或抗体）的检测结果。二、方法类型12

3液体芯片抗体芯片细胞芯片三、关键技术芯片阵列项目合理组合阵列所需抗体库的合理组合微阵列抗体或抗原固化抗原抗体在同一张芯片的集中用荧光等标记免疫技术等显示结果生物样品信息的获取和分析四、方法评价基于高密度抗原或抗体的微阵列技术高通量取得生物信息信息量大、快速、及时、操作简便所需样品量少、生产成本低、用途广泛自动化程度高等优点。五、临床应用

免疫芯片在临床分子诊断学和许多疾病诊断方面具有广泛而重要的应用价值。肿瘤标记物的检测感染性疾病的检测（如肝炎病毒、结核杆菌、幽门螺杆菌等）心血管疾病和自身免疫性疾病的检测细胞膜表面抗原的检测细胞因子的检测、兴奋剂的检测高通量药物筛选、环境和农业检测食品卫生、生物武器等方面的检查。