血液检测技术（临床输血检验课件）

临床输血检验技术ABO血型系统基础理论学习目标掌握ABO血型系统的基因及遗传、ABO血型系统抗体的特点及临床应用、临床常见的ABO亚型。导入：血型是什么？广义的血型：泛指高等动物和人类血液中的红细胞、白细胞、血小板以及各种血浆蛋白质的抗原型别。狭义的血型：仅指红细胞抗原的型别。目前为止，已检出30多个红细胞血型系统，抗原近300个。其中，ABO血型系统是最常用也是最重要的血型系统。ABO血型基因ABO血型基因位于人类9号染色体的长臂3区4带，由A、B、O三个等位基因控制，其中A和B为显性基因，O为隐性基因。A、B基因不直接编码抗原，而是编码连接糖所需的特异性转移酶，这些酶能使糖分子与A、B抗原前体物质（H抗原或H物质）相连接，进而合成AB抗原。A基因编码产生N-乙酰基半乳糖胺基转移酶1该酶将N-乙酰半乳糖胺（A抗原表位或抗原决定簇）连接到H抗原末端的半乳糖上，使之成为A抗原B基因编码产生D-半乳糖糖基转移酶2该酶将D-半乳糖（B抗原表位）连接到H抗原末端的半乳糖上，使之成为B抗原O基因产生的糖基转移酶无活性，不能修饰H物质，因此不产生A、B抗原但表面有大量H物质。ABO血型基因ABH抗原主要存在于红细胞上，但也可出现在除脑脊液外的分泌液中，唾液中最丰富，称为血型物质。意义在于：1.在红细胞抗原弱表达个体中确定ABO血型；2.检测唾液、羊水中的血型物质，辅助鉴定血型和预测胎儿血型；3.能中和天然抗体（IgM），有助于鉴别抗体性质。血型物质ABO血型遗传是常染色体显性遗传。每个子代均可从亲代各得到一个单倍体，组合后共有6种基因型，4种表型。ABO血型遗传（一）天然抗体

ABO抗体多为天然抗体，出生后开始产生，3-6个月时可能被检出，5-10岁达到高峰，80岁降至6个月水平。天然抗体由环境中的与A、B抗原类似的物质在无觉察的免疫刺激下产生，多为IgM，分子量大，不能通过胎盘，一般不会引起新生儿溶血病。ABO血型抗体（二）免疫抗体

免疫抗体不是天然存在血浆中，而是由于输血或妊娠分娩时进入受血者或母体的红细胞抗原（母体缺乏的），使淋巴细胞致敏后免疫产生的抗体，免疫抗体多为IgG，IgG的分子量小，能透过胎盘，因此能引起新生儿溶血病。ABO血型抗体O型人血液中含抗A、抗B和（或）抗AB抗体，其中抗AB不是抗A和抗B的混合物，它识别的是A和B抗原上共同的结构部位。抗AB以IgG为主，效价较高，可以通过胎盘，因此，O型母亲亲子血型不合，易发生新生儿溶血病。ABO血型抗体ABO血型抗体的临床意义：1.ABO不相容的输血可以引起严重的溶血性输血反应，一般为急性血管内溶血反应，严重时可导致DIC、急性肾功能衰竭甚至死亡。2.ABO抗体可引起新生儿溶血病，在器官移植、造血干细胞移植等方面都有重要意义。ABO血型抗体亚型是指虽属同一血型抗原，但抗原结构、性能或抗原表位数有一定差异的血型。1.A亚型常见的A亚型有A1与A2、A3、Ax、Am、Ay等，其中A1、A2亚型占全部A型血的99.9%。ABO血型亚型A1亚型A抗原A1抗原A2亚型A抗原tips1：由于A2型和A2B型血浆中含有抗A1，它们可能在输血时去凝集A1型红细胞，因此A2型的人接受A1型人的血，也可发生输血反应。tips2：A2型和A2B型红细胞膜上的A抗原抗原性较弱，在血型鉴定时，不易与抗A反应，容易将A2型和A2B型误定为O型和B型，因此应特别注意A亚型的存在。ABO血型亚型A1亚型A抗原A1抗原抗A1抗体2.B亚型B亚型要少于A亚型，包括B3、Bx、Bm和Bel等，鉴定技术与弱A亚型鉴定技术相同。亚型通常是在正反定型不符或凝集较弱时通过进一步试验发现，不作为常规检查。ABO血型亚型B细胞上有弱A抗原表达、A细胞上有弱B抗原表达B（A）及A（B）表型A与B基因位于同一条染色体上，两个基因同时遗传顺式AB肠道细菌进入血液后，其脱乙酰基酶使A抗原的N-乙酰半乳糖胺变成半乳糖胺，与B抗原半乳糖相似获得性B特殊ABO血型临床输血检验技术ABO血型鉴定学习目标1、常用红细胞悬液的制备方法2、血型鉴定卡式法、试管法原理、结果判断及质量控制。卡式法1现推荐方法，灵敏度高、重复性好、可自动化操作，但成本较高试管法2传统方法，操作简便、设备简单、成本低廉，但影响因素多、灵敏度低ABO血型鉴定试管法包括盐水凝集试验、低离子强度盐水试验、酶试验、凝聚胺试验、抗人球蛋白试验等，本课以盐水凝集试验为例。现目前两种方法均在临床使用中，故均需掌握。一、红细胞悬液制备常用浓度：1%、2%、5%、10%。方法：①抗凝血移去上层血浆待测

②洗涤：剩余的红细胞中加5MLNS，混匀，洗涤，弃上清，此步骤重复3次，最后一次上清应清亮并全部弃去。

③配制悬液。（根据要求浓度）如5%：洗涤后压积红细胞1滴+19滴NS，混匀3000r/min5min3000r/min5min二、试管法血型鉴定正定型原理：

用特异性血型抗体检测被检RBC,在盐水介质中发生肉眼可见的凝集，从而测定被检RBC膜上有无与特异性血型抗体相对应的抗原，进一步判定血型。正定型方法：加标准血清1滴（-A-B

）加红细胞悬液1滴（5%）混匀，离心观察结果-A-B1000r/min1min二、试管法血型鉴定正定型结果判定：试管法：轻轻摇动（或捻动）试管，使沉于管底的RBC浮起，观察有无凝集或溶血，如上层清亮，管底有RBC凝块，轻弹管底，凝块无散开，为凝集（＋）；如上层清亮，管底有RBC沉积，边缘整齐，轻弹管底，RBC浮起或成为均匀的RBC悬液，则为不凝集（一）；若不确定，可将反应物倒在载玻片上，显微镜下观察。注意：若上层为清亮的樱红色，考虑是否溶血二、试管法血型鉴定抗A抗B结果＋—A—＋B＋＋AB——O正定型结果判定：二、试管法血型鉴定二、试管法血型鉴定反定型原理：

原理：用标准红细胞检测被检血清（血浆）,在盐水介质中发生肉眼可见的凝集，从而测定被检血清（血浆）中有无与标准红细胞相对应的抗体，进一步判定血型。二、试管法血型鉴定反定型方法：加待测血清2滴（-A-B

）加标准红细胞悬液2滴（5%）混匀，离心观察结果-A-B1000r/min1min（方法同正定型）二、试管法血型鉴定抗A抗B结果＋—A—＋B＋＋AB——O正定型结果判定：结果判定：A(RBC)B(RBC)结果＋—B—＋A＋＋O——AB反定型结果判定：二、试管法血型鉴定注意：1、正反定型一致才能确定结果；

2、所用器材必须清洁干净，避免溶血，专型专用；

3、控制离心速度和时间，防止假阳性和假阴性；

4、抗原抗体比例要适当；

5、溶血时，注意结果的判定；

6、正反定型结果不一致时，不可轻易判定，需查明原因，可能有技术问题也可能有标本问题。二、试管法血型鉴定检测原理：

正定型原理：在事先包被好抗A与抗B的凝胶介质中，加入待测的红细胞悬液，抗原与抗体结合，经低速离心，未与抗体结合的红细胞沉于凝胶底部，而已经结合的凝集的红细胞，位于凝胶上部或悬浮与凝胶中。反定型原理：采用中性微柱凝胶，加入待测的血清与标准红细胞悬液，其余同正定型。三、卡式法血型鉴定卡的结构：凝胶微柱：试管上端（反应池）、柱体（分离池）过滤介质：颗粒直径26-103nm的葡聚糖100凝胶，凝胶间缝隙只允许游离红细胞通过缓冲液：LISS（加或不加抗血清）三、卡式法血型鉴定卡式法方法：正定：将待测红细胞悬液加在凝胶上部反应，离心后观察反定：将待测血清和标准红细胞加在凝胶上部反应，离心后观察阳性：凝集的红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央阴性：游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的小柱，而到达小柱的底部

三、卡式法血型鉴定结果判读模式：三、卡式法血型鉴定结果判读模式：三、卡式法血型鉴定卡式微柱凝胶试验就是利用实验中红细胞在凝胶微柱中的移动，来指示肉眼所不能见的红细胞与相应抗体发生的血清学反应，因此只需要更换不同的试剂卡，就能广泛地应用在：红细胞血型鉴定、交叉配血、抗体筛查、新生儿溶血病的检测等。三、卡式法血型鉴定临床输血检验技术HLA分子生物学分型方法学习目标掌握PCR-SSP检测方法的基本原理、特点及其适应范围。原理PCR—序列特异引物法编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。检测材料PCR—序列特异引物法——以B27检测为例

1、血样：0.2mlEDTA抗凝血

2、红细胞裂解液

3、白细胞裂解液

4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersetc操作流程一、DNA的提取1、取1ml红细胞裂解液入血样管中混匀，裂解红细胞;2、离心4000rpm2min;3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；4、取50ul白细胞裂解液入上述白细胞管中混匀；5、将白细胞管于60℃水浴消化20min；6、取出白细胞管再于100℃，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm2min。上清即为富含DNA的PCR模板。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例操作流程PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）

×12×2394oC2min

94oC12sec

65oC1min94oC12sec61oC50sec72oC30sec

37oC10sec

HLA-B27扩增程序PCR—序列特异引物法——以B27检测为例扩增产物电泳PCR—序列特异引物法——以B27检测为例扩增产物电泳制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例结果观察HLA-B27(+)标本电泳结果观察

PCR—序列特异引物法——以B27检测为例试剂操作：提取DNA最后一步，乙醇要挥发干净防止PCR污染质量控制PCR—序列特异引物法——以B27检测为例方法学评价方法评价PCR-SSP该方法操作简单、快速，耗时较短，结果判断简便，但可能出现漏孔或假性条带现象，为实验室最常用方法之一。PCR-SSOP操作较复杂，耗时较长，结果较准确，部分探针易出现干扰。目前被Luminex检测技术所替代。Luminex检测技术灵敏度高，操作简便，快速，结果较准确，是目前实验室中最常用的方法之一。PCR-SBT能够直接检测基因的核苷酸序列，属于高分辨方法，结果准确性最高，但需要特殊的仪器设备，耗时较长，成本较高。基因芯片技术具有超高速、高通量、低成本和高效益等优点，但分型可能存在一定的偏差。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例临床输血检验技术HLA抗体检测技术学习目标熟悉淋细胞毒交叉配合试验的原理、方法及质量控制。HLA血清学分型试验的原理及质量控制。淋巴细胞毒交叉配合试验+补体台盼蓝染液抗原与抗体结合当特异性抗体与待检淋巴细胞表面HLA分子结合后，激活补体，使细胞膜通透性增加或细胞死亡，加入染料后在显微镜下可见结合补体的细胞被活性染料着色。分离淋巴细胞淋巴细胞毒交叉配合试验供者淋巴细胞+受者血清37℃孵育30分钟兔补体2%台盼蓝死细胞体积大，着黑色，无折光性；活细胞大小正常，未着色，折光性强，较透亮；抗体测定-试管法37℃孵育60分钟淋巴细胞毒交叉配合试验质量控制HLA抗原抗体最好选用单克隆抗血清抗体效价适宜存在剂量效应淋巴细胞要求活性和纯度高浓度为2～4×106/mL病理状态下HLA可能会表达异常孵育温度和时间严格掌握孵育时间最适温度为20-25℃其他补体染液应进行预试验；用甲醛固定设置阳性和阴性对照淋巴细胞毒交叉配合试验淋巴细胞毒交叉配合试验<10%或为阴性才能施行肾移植。如果受体以前曾经接受过输血、有过妊娠或接受过同种异体移植，很可能在其血清内已产生抗淋巴细胞抗体，对人类白细胞抗原（HLA）敏感。此时，淋巴细胞毒交叉配合试验可为阳性，器官移植术后将可能发生超急性排斥反应。临床应用临床输血检验技术HLA抗原检测技术学习目标1.熟悉HLA血清学分型试验的原理及质量控制。2.淋巴细胞毒交叉配合试验的原理及质量控制。3.HLA分子生物学分型方法HLA血清学分型试验+补体台盼蓝染液抗原与抗体结合当特异性抗体与待检淋巴细胞表面HLA分子结合后，激活补体，使细胞膜通透性增加或细胞死亡，加入染料后在显微镜下可见结合补体的细胞被活性染料着色。分离淋巴细胞HLA血清学分型试验待检淋巴细胞悬液静置30-40分钟兔补体静置60-70分钟5%伊红死细胞体积大，着黑色，无折光性；活细胞大小正常，未着色，折光性强，较透亮；微量淋巴细胞毒试验HLA血清学分型试验质量控制HLA抗原抗体最好选用单克隆抗血清抗体效价适宜存在剂量效应淋巴细胞要求活性和纯度高浓度为2～4×106/mL病理状态下HLA可能会表达异常孵育温度和时间严格掌握孵育时间最适温度为20-25℃其他补体染液应进行预试验；用甲醛固定设置阳性和阴性对照HLA血清学分型试验

临床输血检验技术

Rh血型鉴定

Rh（D）血型鉴定原理：IgM型抗D标准血清与被检者RBC表面D抗原在室温条件下盐水介质中产生特异性反应，根据是否出现凝集判断是否有D抗原的存在。加抗D血清1滴加红细胞悬液1滴（5%）轻轻摇动玻片混匀，2min内判断结果，有凝集（＋），无凝集需进一步实验确认是否为阴性

Rh（D）血型鉴定临床输血检验技术Rh血型系统基础理论学习目标掌握Rh血型系统的命名方法、Rh抗原、抗体的各类。Rh血型系统概述Rh系统的发现：1940LandsteinerWiener

恒河猴。Rh血型的抗原：已发现40多种，D、E、C、c、e等。Rh系统的命名:Fisher-Race；Wiener；Rosenfield。Rh系统的遗传:遵循常染色体共显性连锁遗传规律。Rh血型连锁遗传规律Rh血型系统的抗原及亚型抗原性强度仅次于A及B抗原；已发现的Rh血型抗原达48个；D抗原抗原性最强,以下依次E、C、c、e；临床将D抗原阳性的个体称为Rh阳性，反之为Rh阴性。Rh血型系统的抗体主要为IgG，应答早期可有部分IgM。抗D与D红细胞产生严重的溶血反应。不同个体对Rh＋抗原刺激存在差异。RBC刺激或输血、妊娠后产生，偶见天然抗E、抗CW。临床输血检验技术白细胞抗原系统基础理论学习目标1.什么是HLA？HLA等位基因的命名应遵循哪些原则？2.HLA-Ⅰ类、Ⅱ类及Ⅲ类基因的结构怎样？HLA复合体的遗传特点有哪些？3.HLA分子的结构怎样？如何命名？HLA复合体HLA复合体的遗传特点单体型遗传

多态性遗传共显性遗传复等位基因连锁不平衡（linkagedisequilibrium）基因频率连锁不平衡现象的可能原因HLA复合体HLA-I类基因位于6号染色顶端经典HLA-I类基因：包括A、B、C三个基因座位，编码三组高免疫性、高度多态性的HLA-A、HLA-B、HLA-C糖蛋白分子。非经典HLA-I类基因：免疫功能关基因，包括E、F、G、H、J基因座位，编码免疫性和多态性均较低的分子HLA复合体HLA-II类基因位于6号染色着丝点经典HLA-II类基因（DP、DQ、DR）编码HLA-II类分子；非经典的HLA-II类基因（LMP、TAP、DM）为与抗原加工和递呈有关的基因。HLA复合体HLA-III类基因位于II类和I类基因中段经典HLA-III类基因编码产生C4、C2、B因子等HLA复合体HLA等位基因命名HLA-A*02：101：01：02N连字符基因座位分隔符基因组字段分隔符特异性HLA蛋白编码区DNA同义突变非编码区DNA差异指示表达发生变化HLA复合体按基因位点的产物分别命名抗原特异性用基因位点后的数字表示由细胞学技术及淋巴细胞试验确定的特异性的表示HLA抗原裂解后宽特异性的表示抗原特异性及基因位点之间的表示HLA分子组织分布HLA分子HLA分子分布HLA-Ⅰ类分子广泛分布在所有有核细胞表面HLA-Ⅱ类分子主要表达在如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等细胞表面HLA分子也分布在血、尿、唾液及精液中检出HLA分子临床输血检验技术白细胞抗原系统检测的临床应用学习目标掌握HLA分型在移植医学、输血医这和法医学中的应用白细胞抗原系统检测的临床应用在移植医学中的应用造血干细胞移植HLA相合同胞（ＭＲＤ）ＨＬＡ相合非血缘（MUD）单倍体脐体器官移植HLA－AHLA-BHLA-DR白细胞抗原系统检测的临床应用在输血医学中的应用HLA与非溶血性输血反应(1)临床输血中发热性非溶血性输血反应多数是由于HLA抗体破坏白细胞后释放出热源物质引起；(2)表现为头晕、面红、恶心、寒战，体温可高达39℃以上，严重者可并发肺部综合征，呼吸困难；(3)采用白细胞滤器过滤后的血液输注，非溶血性输血反应明显减少。

白细胞抗原系统检测的临床应用在输血医学中的应用HLA与血小板输注

(1)30％的HLA抗体阳性者对随机献血者的血小板输注无效；(2)在血小板输注中HLA抗体的产生很少由血小板引起，多数由血小板血液中的白细胞引起；(3)输血小板进行治疗时，最好测定HLA-A、B抗原，防止由于患者产生针对血小板膜HLA抗原的抗体。白细胞抗原系统检测的临床应用在法医学中的应用HLA与亲子鉴定(1)由于HLA复合体的高度多态性，在无关个体间HLA表型全相同的机率极低，故HLA复合体被看作是伴随个体终生的特异性遗传标记；(2)借助HLA基因型和（或）表型检测，可用于法医上的个体识别，使HLA分型成为鉴定亲子关系的重要手段。白细胞抗原系统检测的临床应用临床输血检验技术血小板血型检测的临床应用学习目标掌握血小板血型系统检测的临床应用。血小板血型与临床血小板抗原同种异体抗原

HLA-I,HPA,ABH同种抗原

GPⅡb/Ⅲa,CD36自身抗原

GPⅡb/Ⅲa,GPⅠb/Ⅸ药物依赖性抗原肝素、奎宁等非特异性抗原血小板免疫性疾病血小板输注无效症新生儿血小板减少症输血后紫癜自身免疫性血小板减少症药物引起的血小板减少症移植相关的血小板减少症临床病症淤点淤斑流产（颅内）出血死亡血小板血型与临床输血妊娠骨髓移植致敏血小板并引起破坏抗供者血小板抗体抗父亲血小板抗体抗供者血小板抗体出血/紫癜流产/死胎移植排斥血小板血小板血型与临床采取预防和治疗措施避免流产、出血等减少血小板输注无效避免紫癜、出血和死亡血小板相容性检测抗原定型抗体检测交叉配型建立血小板供者库筛选基因型相容的供者避免血小板抗体的产生诊断血小板免疫性疾病筛查血小板相容性供者临床输血检验技术血小板血型检测技术学习要求掌握简易致敏红细胞小板血清学试验的原理、方法及质量控制。简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn患者血小板反应板（固相化血小板）血小板单层阳性反应阴性反应患者血清/血浆PBS指示红细胞（IgG抗RealhD致敏红细胞）甲醛固定20分钟洗涤5次50μl/孔阳性阴性25μl/孔各25μl/孔原理简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn患者血小板反应板（固相化血小板）甲醛固定20分钟洗涤5次50μl/孔制备固相化血小板血液7mlACD-A液1ml100g*10min富血小板血浆ACD-A液101g*15min生理盐水洗涤5次调整血小板浓度简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn血小板单层阳性反应阴性反应PBS指示红细胞（IgG抗D抗体致敏红细胞）患者血清25μl/孔洗涤2次室温湿盒静置1小时阳性阴性各25μl/孔静置4小时静置4小进间接试验（检查患者血清中的抗血小板抗体）PBS25ul简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn阳性反应阴性反应PBS指示红细胞（IgG抗D抗体致敏红细胞）各25μl/孔静置4小时静置4小进直接试验（检查血小板表面结合的抗血小板抗体）简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn质量控制1．待检的血清或血浆标本检测前应充分离心以去除颗粒及聚焦物，否则会出现假阳性结果；标本脂类含量高或微生物污染也会导致假阳性结果。纤维蛋白原未充分析出的血清标本也会导致错误结果。2．血小板悬液的浓度要符合要求，血小板数量太少、浓度过低将会影响试验结果；特别注意不能将血小板置于4℃冰箱储存。3．待检测的标本只能用血清或血小板，检查前需2800×g离心10分钟以上以去除沉淀，以免颗粒及微聚物造成假阳性；高脂血或微生物污染也会造成假阳性结果。4．指示红细胞使用前未充分混匀或试验中微孔板离心不充分，可导致假阳性结果；过度离心会导致假阴性结果。5．为防止静电干扰，操作过程需在室温湿盒中水湿润状态下进行。简易致敏红细胞血小板血清学试验.cn方法学评价方法评价简易致敏红细胞血小板血清学试验简便快速，可用于血小板抗体（HLA，HPA）检测和交叉配血试验，也可用于血小板抗原的鉴定以及血小板自身和药物依赖性抗体检测。微柱凝胶血小板相容性试验操作简便、快速、敏感性强，结果易于观察，属于微柱凝胶间接血凝试验。可用于血小板交叉配血试验、血小板抗体筛检和致敏血小板检测等。单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验敏感性强，可以检测出血小板膜上微量表达的HPA-5抗原。可用于鉴定血小板抗原和血小板同种特异性HPA抗体，以及血小板交叉配血试验。但由于HPA定型血清来源困难，本方法主要用于对部分HPA基因定型结果的验证。改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验特异性较高，血小板无需氯喹或酸预处理就能区分血清中的HLA和HPA抗体。主要用于血小板抗体特异性鉴定试验，以便血小板抗体阳性患者输注对应抗原表达阴性的供血者血小板。流式细胞术可用于鉴定血小板抗原，也可用于检测血小板抗体和交叉配合试验，虽然敏感性很高，但需要特殊仪器和专业操作人员，成本较高。分子生物学检测PCR-SSP是最简单常用的测定血小板HPA基因型的方法。PCR-RELP法比较简单，DNA纯度要求不高，实验重复性好，适合大批量检测。PCR-ASO特异性强，但杂交过程费时、繁琐，杂交背景较强或杂交信号较弱时，结果难以判断。

血小板血型系统基础理论学习要求掌握血小板血型系统相关抗原与特异性抗原、血小板抗体的特征。血小板血型系统抗原.cn血小板：D:2~5µm