PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌-O157-H7特异性和灵敏性的比较

PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌O157:H7

特异性和灵敏性的比较

湖北检验检疫局技术中心赵晖zhaohui@论文撰写背景：本论文的研究内容是在澳大利亚伊丽莎白－麦克阿瑟农业研究所访问研究期间所做实验的一部分。国外一直很重视对O157:H7的研究工作，完成论文时，刚好FDA公布了O157:H7的暴发事件。这篇论文是专门为这次征文活动而写的，希望能完善和建立最适合检验检疫运用的O157:H7快速检验方法。简介本文中采用的是普通PCR检测方法，因为目前普通PCR已经是一种简单而经济的方法，在国外被广泛采用，趋于成熟和稳定，我们将这种方法用于日常检测应该是可行的。本文所用的3种检测目的基因和4种致病基因是从众多的文献中筛选出来的。实验目的

通过对PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌O157:H7特异性和灵敏性的比较，以选择一种用于样品中O157:H7检测的最佳方法。实验方法

用单一PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测O157:H7和非O157:H7菌株31株，比较检测的特异性。用纯化的O157:H7基因组DNA以及从1.7×107

～1.7个O157:H7细菌中提取的DNA为模板这两种方法比较分别扩增三种基因检测的灵敏度。菌株本试验所用菌株均为澳大利亚伊丽莎白－麦克阿瑟农业研究所(ElizabethMacarthurAgriculturalInstitute)免疫微生物实验室保存菌株(表1)，所有大肠杆菌血清型均经墨尔本大学微生物系鉴定。试验菌株分别接种于Luria-Bertani(LB)肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜（12～16h）。细菌DNA模板制备

快速加热法：用InstaGeneMatrix试剂盒(BIO-RAD,澳大利亚)制备DNA模板。

纯化的DNA模板：用Promega

的DNA纯化试剂盒（Promega,澳大利亚）制备纯化DNA。试验用引物目的基因引物序列产物大小(bp)参考文献uidA5'-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3'252Cebula等[4]5'-TGATGCTCCATAACTTCCTG-3'rfbE5'-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3'159Sharma等[5]5'-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3'FliCH75'-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3'625Gannon等[6]5'-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3'PCR反应

扩增rfbE和fliCH7基因的反应程序.扩增uidA基因的反应程序.致病基因的检测

所有大肠杆菌菌株均采用AdrienneW.Paton

和JamesC.Paton的多重PCR方法检测4种大肠杆菌致病基因：stx1、stx2、eaeA和ehxA[3]。

PCR检测的特异性

以包括O157:H7等血清型的18株大肠杆菌和13株非大肠杆菌的DNA为模板（快速加热法制备），以PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因用于PCR特异性检测。PCR检测的灵敏度

采用两种方法测定（1）用纯化的O157:H7的DNA为模板。（2）用快速加热法分别提取梯度稀释的O157:H7菌悬液的DNA作为模板，同时对每个稀释梯度中的O157:H7进行平板菌落计数。

实验结果特异性的比较结果：所有大肠杆菌O157菌株扩增出了rfbE基因；O157:H7、H－、H1、HN、O75:H7和H－都扩增出了fliCH7基因；O157:H7、H－、H1和HN均扩增出uidA基因；其他菌株都没有扩增产物。灵敏度的比较结果：（1）扩增三种基因的检测灵敏度均为10pg纯化基因组DNA，（2）扩增uidA和rfbE基因，PCR检测的灵敏度均为1.7×102个细菌；扩增fliCH7基因，PCR检测的灵敏度为1.7×101个细菌。菌株名称血清型来源携带的致病基因目的基因扩增结果stx1stx2eaeA

ehxAuidA

rfbEfliCH7大肠杆菌O157:H7腹泻病人+++＋+++O157:H7腹泻病人+++＋+++O157:H-腹泻病人+++++++O157:H-腹泻病人+++++++O157:HNb腹泻病人+++++++O157:H1腹泻病人+++++++O157:K88腹泻病猪－－－－－+－O75:H7腹泻病人－－－－－－+O75:H-腹泻病人－－－－－－+O111:H-腹泻病人＋＋＋＋－－－O111:H8腹泻病人++++－－－O26:H11腹泻病人＋－＋＋－－－O113:H2腹泻病人－＋－＋－－－EcoR60O4:HN腹泻病人－－－－－－－DH5

NTc－－－－－－－O141:K85ac:H-腹泻病猪－＋－－－－－O138:K81:HN腹泻病猪－－－－－－－O149:K88腹泻病猪－－－－－－－非大肠杆菌a－－－－－－－表1特异性试验菌株及其携带的致病基因以及目的基因PCR扩增结果

讨论针对O157:H7的rfbE基因设计的引物均有很高的特异性。fliCH7基因对检测O157:H7有辅助鉴定作用，但在直接对样品进行快速检测时，用rfbE和fliCH7基因同时检测O157:H7似乎没有意义，此方法更适用于已经分离纯化菌株的鉴定。多种大肠杆菌均携带4种致病基因，因此用致病基因作为目的基因的多重PCR检测方法只适用于纯化菌株的致病分析，而将它们直接用于对样品的检测是不可靠的。讨论一般待测样品中的菌相复杂，同时存在多种细菌，用多重PCR直接对样品中的O157:H7进行检测鉴定，容易出现不正确的结果。按常规检测O157:H7的方法，O157:H－就会漏检，用PCR方法结合血清学和生化鉴定方法将可以解决这些问题。用PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测O157:H7，都必须结合血清学等鉴定方法才能区别H7、H－、H1和