生物学基本技能 教案ⅩⅢ 离心操作

基本技能ⅩⅢ离心操作一、目标与任务本次教学主题基本技能ⅩⅢ离心操作学时授课班级授课日期授课地点主讲教师实验目的1.了解离心机的类型、结构原理及使用注意事项。2.掌握各种离心机的操作技术和技能。3.掌握离心机的一般维护和维修技能技能分解常用离心机类型常用离心管类型离心原理和技术参数离心机操作技术离心机的日常维护、常见故障及排除实验操作实训思政元素增强责任意识；培养实事求是的精神；理论与实践相结合教学方法讲授法、演示法、讨论法、案例分析法、课堂观摩法、实训法教学媒体教材、课件、教案、多媒体、投影仪二、教学进度教学过程教学内容教学活动教学时间（分钟）教师活动学生活动理论知识讲授一、常用离心机类型二、常用离心管类型（一）按离心管材质分类·塑料离心管。塑料离心管常用的材料有聚乙烯（PE）、聚碳酸酯（PC）、聚丙烯（PP）等，其中聚丙烯管性能相对较好。塑料离心管的优点是硬度小，可用穿刺法取出样本；缺点是易变形、抗有机溶剂腐蚀性差、使用寿命短。·玻璃离心管。使用玻璃离心管时离心力不宜过大，需要垫橡胶垫，防止管子破碎。高速离心机一般不选用玻璃离心管。玻璃离心管盖封闭性不够好，液体不能加满(针对高速离心机且使用角转子)，否则会使液体外溢，失去平衡。外溢后果是液体污染转子和离心腔，影响感应器正常工作。超速离心时，液体一定要加满离心管，因为超速离心需要抽高真空，只有加满才能避免离心管变形。·金属离心管。金属离心管一般采用不锈钢材质。不锈钢离心管具有强度大、不变形、抗热、抗冻、抗化学腐蚀等优点。其主要用于工业生产，但同时要注意避免接触如强酸等腐蚀性的化学物质。（二）按离心管底部形状分类·锥形离心管。也称为尖底离心管，底部为锥形。当样品量少而需收集沉淀时，用锥形离心管更容易分离，上层液更容易用吸管吸取，是使用最多的离心管。·平底离心管。用途和锥形离心管相同，但平底离心管可以立放，实验中更方便放取。·圆底离心管。当进行密度梯度离心时，最佳选择是圆底离心管，圆底底面积大，较锥形底能承受更大的离心力。（三）按离心管容量分类·微量离心管。微量离心管是一种小型的离心管，又称EP（eppendorf）管，常与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离。其常见容量规格有0.2mL、0.65mL、1.5mL、2mL。·普通离心管。普通离心管是实验室最常见的离心管，常见的容量规格为15mL、30mL、50mL。·大容量离心管。大容量离心管又称为离心瓶或离心杯，是大容量细胞收获、切粒和蛋白纯化的离心选择，常用于工业化生产。其常见的容量规格为250mL、500mL、600mL。（四）按离心管盖闭合方式分类·压盖离心管。以按压方式密封的离心管，常见于微型离心管，都属于压盖离心管。·螺旋盖离心管。容量50mL以上的离心管以螺旋盖离心管为主。螺旋盖离心管又可分为平盖（盖子顶部是平的）和塞盖（盖子顶部有塞子形状）。三、离心原理和技术参数（一）基本概念·离心力（centrifugalforce,Fc）。离心力是指由于物体旋转而产生脱离旋转中心的力，也指物体做圆周运动所产生的向心力的反作用力。当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动，这种运动称为离心运动，也叫离心现象。·相对离心力（relativecentrifugalforce,RCF）。通常颗粒在离心过程中的离心力是相对于颗粒本身所受的重力而言，因此把这种离心力称为相对离心力，其单位是重力加速度“g”。由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力也不同。·沉降速度（sedimentationvelocity)。沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。·沉降时间。在实际工作中，常常遇到在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需要多大转速与多长时间的问题。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需要的时间，即沉降时间。·K系数。用来描述在一个转子中将粒子沉降下来的效率。K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关，所以K系数是一个变数。·沉降系数。沉降系数是指颗粒在单位离心场作用下的沉降速度，其单位为秒。各种生物样品的沉降系数差别很大，利用沉降系数的差异，可以应用离心技术来定性和定量地分析及分离制备。（二）离心技术原理离心技术是指利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或悬浮密度的差异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。·差速离心技术原理。差速离心技术又称为分步离心技术，是利用不同颗粒在离心场中沉降系数的差异，在同一离心条件下，通过不断增加相对离心力，使不同沉降系数的粒子分离的离心方法。·速率区带离心技术原理。速率区带离心技术是根据分离粒子的沉降系数不同，在某一离心力的作用下，使具有不同沉降速度的粒子在梯度液中处于不同的密度梯度层内，形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的技术。·等密度区带离心技术。采用等密度区带离心技术离心时，需要在离心前预先制备密度梯度液，包括被分离样品中所有粒子的密度。待分离的样品与梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成一个从离心管底部到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；当液面处粒子密度大于介质密度时，粒子沉降，最后粒子进入一个它本身的密度位置，即粒子密度等于介质密度，粒子形成纯组分区带。（三）技术参数1.离心机的主要技术参数（1）最大转速：最大转速指离心机转头可达到的最大转速，单位是rpm或r/min。（2）最大离心力：最大离心力指离心机可产生的最大相对离心力，单位是g。（3）最大容量：最大容量指离心机一次可分离样品的最大体积，通常表示为m×n，m为一次可容纳的最多离心管数，n为一个离心管可容纳分离样品的最大体积，单位是mL或L。（4）调速范围（转速设置范围）：调速范围指离心机转头转速可调整的范围。（5）温度控制范围：温度控制范围指离心机工作时可控制的样品温度范围。（6）工作电压：工作电压一般指离心机电机工作所需要的电压。（7）电源功率：电源功率通常指离心机电机的额定功率。2.离心机转头的主要技术参数转头（rotor）是离心机分离样品的核心部件，它的转速与转子的材料及强度有关。低速离心机一般采用超硬铝合金；超速离心机采用钛合金。一般来说，同一类型离心机，重量轻、容量小的转头转速要高；反之，转速要低。离心机常有多种不同形状的转头，其各自所反映的离心力场的大小和沉降距离也不一样，在实际工作中应根据分离要求正确选择使用。四、离心机操作技术（一）低速离心机（lowspeedcentrifuge）1.结构低速离心机的结构较为简单，由电动机、离心转盘（转头）、调速装置、定时器、离心套管与底座等主要部件构成。电动机是离心机的主要工作部件，一般多为串激式电动机，包括定子和转子两部分。离心转盘（转头）常用铸铝制成，是平顶锥形。电动机的调速装置有多种，如多抽头变阻器、瓷盘可变电阻器等形式。离心套管主要用塑料或不锈钢材料制成。2.适用范围主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物，临床上主要用于血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有效成分的分离。3.操作步骤（1）离心前准备（2）运转前检查（3）离心操作4.操作注意事项（二）高速离心机（highspeedcentrifuge）1.结构高速离心机通常有转动装置、速度控制系统、真空系统、温度控制系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。2.适用范围主要用于细菌的蛋白沉淀、核酸提取，细胞或亚细胞组分分离，动、植物病毒分离，血液血清提取及溶液中大小颗粒不同组分的分离等。3.操作步骤（1）离心前准备（2）运转前检查（3）离心操作4.操作注意事项（三）超速离心机（ultracentrifuge）1.结构超速离心机主要由驱动装置、速度控制系统、温度控制系统（由安装在转头下面的红外线测量感受器直接并连续检测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控）、真空系统、转头及安全保护装置组成。2.适用范围超速离心机按用途分为制备型、分析型及分析制备型三种。制备型超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒的分离纯化，能使亚细胞分级分离，并可用于测定蛋白质及核酸的分子量。分析型超速离心机装有光学系统，可拍照、测量、数字输出，有自动打印系统等，可通过光学系统对测试样品的沉降过程及纯度进行观察。分析制备型超速离心机将分析型和制备型超速离心机的优点结合在一起，使得设备更完美。3.操作步骤4.操作注意事项（四）管式离心机（tubularcentrifuge）1.外形结构为了减小离心机转鼓所承受的应力，使物质有足够的沉降时间，把离心机的转鼓（相当于离心管）直径变小，长度加长，类似一根长管子，故称管式离心机。结构包括主轴、压紧轮、电机、机身、进液部分、转鼓和集液盘等。2.适用范围管式离心机是利用离心力来达到液体与固体颗粒、液体与液体的混合物中各组分分离的机械设备。管式分离机是目前使用离心法进行分离的理想设备，主要用于液-固、液-液或液-液-固三相分离，其最小分离颗粒为1μm。特别是对一些液固相比重差异小，固体粒径细、含量低，介质腐蚀性强等物料的提取、浓缩、澄清较为适用。3.操作步骤（五）三足离心机（threecolumncentrifuge）1.结构又称为三足式离心机，因底部支撑为三个柱脚，以等分三角形的方式排列而得名，是一种固液分离设备。2.适用范围主要分为过滤式和沉降式两种分离形式。（1）过滤式：转鼓开孔，附加过滤介质通过拦截的方式做到固液二相分离的离心机统称为过滤式离心机。过滤式离心机适用于物料黏度小、固相颗粒不易变形（如结晶体）且较大的小批量生产，多用于工业脱水。（2）沉降式：沉降式离心机设备转鼓为密闭桶状，该设备工作原理是通过离心力做到固液二相分离，这种形式的离心机统称为沉降式离心机。沉降式离心机适用物料广泛，黏度大，固相颗粒小的物料都能通过提高离心力的方式来达到固液二相分离的要求。3.操作步骤五、离心机的日常维护、常见故障及排除（一）离心机的日常维护（1）离心机的安放必须选择坚固的水平台面，放置平稳，底座橡皮四角要紧贴台面，防止工作时发生震动。（2）对离心机套管要定期检查，以便及时发现套管内是否有异物或污垢，发现橡胶垫脱落要立即处理，以保持离心机的平衡。（3）离心机转子、套管要保持清洁，每周要用2%戊二醛消毒一次，最后用蒸馏水冲洗，软布擦干装好备用。（4）当天使用离心机后，要打开门盖，使潮气去掉，避免长期使用造成部件腐蚀。（5）较长时间不用时要将离心机转子取出，用干净的纱布擦干。在离心室内放入干燥剂，防止驱动轴生锈。（6）大容量冷冻离心机的转子座不能磕碰，不能损伤锥面。要定期用软布将转子座及转子锥孔擦干净，并涂少许凡士林，避免摩擦造成损坏。（7）离心机台面禁止放其他物品，以防板面划伤。离心机部件（转子、离心套管等）定期消毒时禁止使用腐蚀性强的次氯酸钠溶液（84消毒液），最好用2%戊二醛消毒液。（二）离心机常见故障及排除1.电机不转（1）主电源指示灯不亮：检查保险丝是否熔断，电源线、插头、插座是否接触良好。（2）主电源指示灯亮而电机不能启动：检查波段开关、瓷盘变阻器是否损坏或连接线是否断脱，检查磁场线圈的连接线是否断脱或线圈内部是否短路。2.转头损坏转头因金属疲劳、超速、过应力、化学腐蚀、选择不当、使用转头不平衡及温度失控等导致离心管破裂，从而造成样品渗漏而损坏转头。电机上