DB41T 706-2011 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法

DB41河南省质量技术监督局发布I1猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法二重反转录聚合酶链式反应(二重RT-PCR)二重RT-PCR是在同一反转录体系内加入两条分别针对二种病毒相应基因序列的反转录过一次PCR反应，可同时扩增出二种病毒相应核酸片段的RT-P酯（DEPC）处理水（见附录A）2℃~8℃保存。PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力应在12000×g以上电泳仪和水平电泳槽，恒温水22℃~8℃冰箱20℃冰箱，单道微量移液器（0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL~），4样品的采集、处理、存放及运输4.1样品的采集及处理4.1.1组织样品用无菌的剪刀剪取猪小肠组织0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，或用刀片刮取病死猪胃肠道粘膜放入无菌1.5mL离心管中，加0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，将组织悬液转入无菌1.5mL4.1.2肠内容物样品无菌取小肠内容物样品3g，置于无菌离心管中，加0.5mL～1.0mL肠内容物悬液混匀，4℃条件-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。4.1.3肛门拭子样品4.2存放与运送采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h，密封后，冷藏保存，及时运送到实验室。若需长期保存，应放置于－40℃以下处冷冻保存，应避免5操作方法）；）；），上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品3配制反转录反应混合液（反转录反应混合液组成参见附录C.2.1向每管中分别加入5.1.6中相灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃配制PCR反应混合液（PCR反应混合液组成参见附录C.2.2），在室温下融化后，瞬时离心使液体全PCR扩增条件：95℃预变性5min后，94℃45s，51℃45s，72℃延伸10min。扩增反应结束后取出放置于2℃~8℃。5.4PCR扩增产物的电泳检测-1)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5µL～10µLPCR扩增产物分别和1µL～2µL的6×上样缓冲液混合猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒阳性对照的PCR产物，经电泳后在869bp和448bp位置异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则4在试验结果成立的前提下，如果待检样品的PCR产物电泳后在869bp和448bp的位置上同时出现特异特异条带，判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阳性（参见附5试剂的配制-1（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：Na2HPO42O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1000mL。A.5DEPC处理水：用0.1%A.6阳性对照样品：经灭活的猪流行性腹泻和猪传染A.7阴性对照样品：正常细胞培养液。6猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验所猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验所用引物见PCR扩增上游引物5'-TCATTCTTCAACCCCATAAC-3'PCR扩增下游引物5'-AAGGAATTGTCCAGTCTTAG-3'PCR扩增上游引物5'-CTGCGTTCTTGTATGGTGT-3'PCR扩增下游引物5'-TGAAGCATTGACTGAACGAC-3'7猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组C.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验反应混合液组成见表C表C.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试PCR反应混合液40µL150µLC.2.3裂解液的主要成分是TriZol，C.2.4DEPC水，用0.1%DEPC处理后的去离子水，经121℃15min高压处理，用于溶C.2.5反转录反应混合液中分别含猪传染性胃肠炎或流行性腹泻病毒反转录引物、反转录酶及各种离8C.2.6PCR反应混合液中含猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异