分子遗传学第五章

物理图的绘制原因遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序?为何要绘制物理图?原因有2个遗传图的分辨率有限微生物基因组较小，记录成百上千次重组试验就能获得十分详尽的遗传图，标记分布密度仅为数千核苷酸。人类及大多数高等真核生物由于不可能获得大量的子代，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨力受到很大限制。最好的一份人类遗传图其标记密度平均为599kb，还不能直接用于指导全基因组的测序。离每100kb一个标记的要求仍差距甚远，后者是进入基因组全面测序的前提。高密度基因组图仅仅采用遗传作图技术是无法完成的，必须借助于其他非遗传分析的方法。遗传图的精确性较低Sturtevant的关于交换是随机发生的猜想部分正确，因为重组热点的存在使染色体某一区段的交换频率高于其他区段。特别是倒位区段，由于受到交换限制，无法绘制精细遗传图。遗传图的局限性表明，在进行大规模的DNA测序之前，对大多数真核生物的遗传图必需进行验证并利用其他作图技术予以校正和补充。遗传分析将基因及DNA标记定位在染色体上绘制的遗传图。另一种基因组作图，即直接检测DNA标记在染色体上的实际位置。物理作图技术最有用的方法为以下4类：限制性作图它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。荧光标记原位杂交(FISH)

将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。

顺序标签位点(STS)作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。依靠克隆的基因组作图

根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理连锁图。物理图的绘制方法1、限制性作图2、荧光标记原位杂交3、顺序标签位点(STS)作图

1、限制性作图

RFLP标记是由限制酶酶切产生的一段DNA片段。不同限制酶识别的顺序各异，大多数限制酶的识别顺序为4、5或6个碱基对，7、8甚至更多的碱基对。

（1）、限制性作图的基本原理

构建限制图的方法是比较不同限制酶产生的DNA片段的大小。首先用一种限制酶处理样品，经琼脂糖凝胶电泳分离染色后可见大小确定的DNA片段。然后用第二种限制酶处理，获得第二组片段。最后用2种酶混合处理，获得第三组片段。收集所有上述资料进行对比组装，对于2种酶切位点交替出现的区段，利用加减法即可确定酶切位点的相对位置。在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列顺序可有多种选择，此时采用部分酶切的办法使该区段只发生一次酶切，然后计算产生片段的长度，选择其中正确的排序。后者称为部分限制作图。部分限制作图可提供完整物理图绘制所需的信息，但是当涉及的限制位点过多时，这种方法就显得力不从心。特别是内部含有大小相同的片段时，位置重叠的片段无法区分，使排序变得非常复杂。此时可采用末端同位素标记结合部分酶解的方法进行物理图绘制。（2）、DNA分子限制性作图如果样品中仅存在较少的限制性位点，用常规的限制酶即可绘制DNA物理图。随着切点数目的增多，单酶切，双酶切及部分酶切产生的条带数成比例扩大，需要对大量的片段进行比对与组装。因为大量片段经琼脂糖凝胶电泳分离时总会有些片段相互贴近，增加了分辨单个条带的困难，很可能遗漏一些片段。限制性作图只能应用于较小的DNA分子，其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率。通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50kb以下DNA分子的精确作图，但50kb远低于细菌及真核生物染色体的长度，只可覆盖少数病毒和细胞器基因组。限制图能否用于大于50kb基因组的作图呢?

稀有切点限制酶限制性内切酶是一类可与DNA结合并在特别的顺序位置切割DNA的酶。因其切割位点有专一性，常用于RFLP分析、限制性作图的操作。有3种限制性内切酶，I型和Ⅲ型对酶切位点的特异性要求不太严格，Ⅱ型限制性内切酶只能在完全正确的顺序切割，专一性很强。例如来自大肠杆菌的限制酶EcoRI的切点总是5’—GAATTC—3，据此可预测已知顺序的DNA经酶切后产生的片段大小及其数目。2500多种限制酶，其中有300多种常用于实验研究。许多限制酶的识别顺序为6碱基对，其他一些识别顺序或长或短，有一些限制酶可识别兼并的碱基顺序，如来自流感嗜血杆菌的限制酶Hinn可识别5’—GANTC—3’,其中N代表4种碱基中任何一种。限制酶切割DNA有2种方式，一种是平端切，即切头无单链突出。另一种可产生粘性末端，即在切口位置留下5’突出或3’突出的核苷酸，一般为4个或2个核苷酸伸出。具有同一粘性末端的片段可以相互匹配，如果加入DNA连接酶将缺口补平，则形成稳定的DNA分子。2个具有平端的DNA片段亦可由连接酶将其彼此结合，但效率较低。获得理想大小的DNA片段对基因组的限制性作图至关重要，其关键是选择合适的限制酶。限制酶识别位点的核苷酸数目与组成决定了该酶产生的DNA片段的大小。如果基因组中4种碱基的分布是随机的，预期产生的限制性DNA片段大小为4n,n代表限制酶识别位点的碱基数目。椐此可以推算：常用的4或6碱基对识别顺序的限制酶只能产生较小的DNA片段，要获得大于50kb的DNA片段必须采用稀有切点限制酶。稀有切点限制酶系指该酶识别的碱基顺序在基因组中只有很少数量，可产生较大的DNA片段。稀有切点限制图绘制选用稀有切点限制酶时有几点必须注意：①一般而言，识别顺序越长产生的片段越大。②识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。例如，人类基因组像其他哺乳类一样，其DNA的A／T比例接近60％。如选用高比例A／T位点限制酶，产生的片段数多于高比例G／C识别位点酶。③有些限制酶识别位点较长，如酵母编码的I—Sce识别顺序为18bp，即使高等真核生物基因组亦无此序列。此时可采用变通的方法，将这类识别位点引入待测的基因组中。④基因组DNA的甲基化状态。基因组DNA分子的顺序并非完全随机分布，某些特异限制酶识别顺序只分布在一定的区段。例如人类基因组DNA中5’—CG—3’的顺序极少，因为人细胞中具有将5’—CG—3’中胞嘧啶5—碳原子甲基化的酶，产生的5—甲基胞嘧啶在生理条件下极不稳定，脱氨基后转变为胸腺嘧啶。在漫长的进化历史中，人类基因组中原有的许多5’—CG—3’顺序由于甲基化突变逐渐转变为5’—TG—3’顺序。活细胞中大量5’—CG—3’顺序的胞嘧啶被甲基化(5—meC)，许多切点含有5’—CG—3’序的限制酶在人类基因组DNA中只能找到很少可切位点。如限制酶SmaI(5’—CCCGGG-3’)处理人类基因组DNA产生的片段平均长度为78kb；NotI是一个8核苷酸限制酶，靶序列(5’—GCGCGCGC—3’)在人类基因组DNA中平均每1Mb含一个切点。限制性作图的潜力随使用的稀有切点限制酶种类而增加，在低等生物基因组以及大分子DNA克隆片段的物理图绘制中被广泛采用。大分子DNA片段的分离DNA分子的长度与其在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率仅在很小的范围内成线性关系，随着DNA分子长度的增加，凝胶电泳的分辨力急剧下降。常规琼脂糖凝胶电泳即使在低浓度的凝胶条件下，也只能分离约30kb以下的线性分子。30kb以上的DNA在常规电泳凝胶中彼此挤压，形成单一DNA迁移带。稀有切点限制酶产生的DNA片段往往超过50kb，如NotI酶切片段可达1000kb，必须用特殊的凝胶电泳技术才能分离与观测。Cantor首次采用一种新的电泳技术，即脉冲凝胶电泳(PFGE)突破了琼脂糖凝胶分离大分子DNA的限制。在不改变凝胶浓度、电场强度和缓冲液的条件下，脉冲凝胶电泳使大分子DNA的分辨力提高于2个数量级，达到10Mb。PFGE的基本原理：将一个方向不断变换的电场取代简单的单一电场(单向电场)，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，达到分离的目的。凝胶中的DNA分子在电场方向不断变换的作用下，随时改变泳动的方向。小分子DNA比大分子DNA更易在凝胶中重新定向，因而迁移速度更快。根据同一原理设计的电泳技术还包括：夹角等值均一电场（CHEF)电场逆转凝胶电泳（FIGE)。交变电场分辨大分子DNA的范围远远超出常规电泳，可将酵母14条染色体彼此分开。

大肠杆菌基因组限制性酶切位点物理图大肠杆菌基因组全长4.5×106bp,NotI酶切产生了21个片段，长度在20～1000kb之间,经脉冲凝胶电泳分离后，将酶切片段转移到杂交膜上,选用已经遗传定位的基因为探针与之杂交，可确定各酶切片段排列位置。2、荧光标记原位杂交

荧光原位杂交(FISH)与同位素杂交的原理相同，只是标记物不同。FISH的荧光标记信号特点：可在显微镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置

（1）、同位素或荧光标记探针的原位杂交染色体DNA成为单链，只有单链DNA才可与同样是单链的互补探针杂交。温和的染色体DNA变性方法不破坏染色体的自然形态，其程序是首先将样品涂抹在载玻片上自然干燥，然后用甲酰胺处理使其变性。早期的原位杂交大都采用同位素标记探针，但效果不尽人意。原因在于同位素标记很难兼顾敏感性与分辨率。敏感性要求放射性标记具有较高的发射能量，但发射能量过高会使信号扩散从而降低分辨力。用能量较低的同位素可提高分辨力，但因其敏感性低。20世纪80年代末由于非同位素标记化合物即DNA荧光染料的发现使上述问题迎刃而解。这些标记化合物将高敏感性与高分辨力集于一身，从根本上改进了原位杂交的效果。为了使敏感性尽可能提高，可选用能产生极强信号的荧光物质。常选择长链DNA分子作为探针，一般不少于40kb的DNA片段。（2）、原位杂交的操作原位杂交最初利用的是细胞分裂中期染色体。染色体处于高度浓缩状态，有可分辨的染色体带型及明显的着丝粒位置，各条染色体带有各自的形态，有可识别的带型。对特定探针而言，原位杂交所显示的中期染色体荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离是不变的，经过比例换算可将其标定在连锁图上。中期染色体的不利之处在于分辨力较低，要求2个分子标记之间至少需隔开

1000kb。中期染色体的原位杂交不适合构建可利用的染色体物理图，主要用于确定新发现的分子标记属于哪条染色体，给出十分粗略的染色体定位。

原位杂交的分辨力取决于杂交的技术以及染色体所处的状态。中期染色体过于收缩不适于精细作图，为改进作图精度，必须采用处于更为伸展的染色体。有2种方法可达此目的：机械伸展的染色体将中期细胞核稍作修改即可获得伸展的染色体，离心可产生剪切力使染色体的伸展长度增加20倍。用这种方法制备的单个染色体形态仍可识别，其原位杂交信号的作图与正常的中期染色体作图相同。非中期相染色体提高分辨力考虑，间期染色体更为适用。已有一些改进的染色体制备方法可获得既松散又保持分辨特征的染色体。3、顺序标签位点(STS)作图

限制性作图虽然快速，并可提供详细的信息，但不适合大基因组。原位杂交因其操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记不超过3～4个。因此绘制详细准确的物理图还必需寻找更有效的技术。

构建最为详细的大基因组物理图的主流技术为STS绘图。顺序标签位点（STS)是一小段长度在100～500bp的DNA顺序，每个基因组仅1份拷贝，很易分辨。原理：当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这2个片段彼此重叠。2个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置靠得多近。如果它们彼此邻接，这2个STS总会同时出现在相同片段上。如果它们相距甚远，有时会在同一片段，有时则在不同片段。要将一组STS作图定位，必须收集来自同一染色体或整个基因组随机断裂的DNA片段。依次采用单个STS挑出它们所在的DNA片段，根据它们彼此的重叠关系可以逐段绘制DNA物理图。一般可用杂交但更多地是用PCR来分析STS所在位置，这一程序已经机械化，可自动操作。STS的分析资料可用来估算2个分子标记之间的相对距离。连锁分析中，位点间的图距与2个标记之间的交换频率有关。STS作图中，标记之间的图距依赖于两点之间断裂的频率。（1）、任何单一DNA顺序都可作为STS

作为合格的STS要满足2个条件：它应是一段序列已知的片段，可据此设计PCR反应来检测不同的DNA片段中是否存在这一顺序；STS必须在染色体上有独一无二的位置。如果某一STS在基因组中多个位点出现，那么由此得出的作图数据将是含混不清的。

常用寻找STS的办法有以下几种：①表达顺序标签(EST)

这是一些从cDNA克隆中找到的小段顺序。因为细胞中的mRNA来自编码蛋白质基因，因此cDNA代表了mRNA所在细胞中表达的基因。EST被视为一种获取重要基因的捷径，即使其顺序不全，仍具有重要价值。EST可转变为STS，条件是这个EST来自单拷贝基因而非基因家族成员，后者常常含有相同或相似的顺序。②SSLP

微卫星序列和其他的SSLP在遗传作图中的应用。SSLP像STS一样也可用于物理作图。③随机基因组顺序从克隆的DNA中随机测序可获得有用的序列，也可从数据库中寻找所感兴趣的某些顺序。(2)、STS的物理图定位

STS作图程序的第二个内容是将已知的STS定位在染色体或基因组中的DNA区段，这些STS标记和作图用的染色体区段以及DNA克隆有时又称为作图试剂。有2种方法用于STS的物理图定位：

辐射杂种辐射杂种是含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞(1996)。

Harris他们发现将人体细胞暴露在3000～8000rad剂量的X射线中可引起染色体随机断裂，辐射的X射线剂量越大，产生的染色体片段越小。经强辐射处理的人体细胞很快死亡，但若在辐射后立即将处理过的细胞与未辐射的仓鼠或其他鼠类细胞融合，有些人体细胞染色体片段将会整合到鼠类染色体中进行扩增。辐射与融合基因转移(IFGT)。化学试剂PEG(聚乙二醇)或仙台病毒可诱导细胞融合。鉴别杂种细胞：常规的办法是选用一种不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷细胞，这种细胞在添加次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸苷的培养基(HAT)中是致死的。将融合的细胞置于HAT培养基中，凡是从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的杂种细胞都可在选择性培养基中生长，由此获得一系列随机插入人类DNA片段的杂种细胞。通常选择到的每个阳性杂种细胞系可保留

5～10Mb大小的人细胞染色体片段，约占人类基因组的15％～35％。这些杂种细胞的集合体称为辐射杂种群，可作为一种作图试剂用于STS定位。每次从杂种细胞分离DNA，用PCR检测杂种细胞中含有的STS标记，根据成对STS出现的频率，可判断这些标记是否连锁以及连锁程度。辐射杂种的作图单位为厘镭(centiRay，cR)，其定义为DNA分子暴露在N拉德X射线剂量下两个分子标记之间发生1％断裂的频率。显然2个标记在染色体上的位置离开越远，其间发生断裂的可能性越高。由于断裂的染色体片段在杂种细胞中随机整合，因而两个标记滞留在同一杂种细胞中的比例与其之间的连锁关系成正比。人类辐射杂种图的若干特征人类基因组辐射杂种作图最初是采用特定染色体而非整个基因组，因为单个染色体作图所用的杂种数量要比全基因组少得多。一个高分辨力的单个染色体的作图要求约100～200个杂种群，很适合常规的PCR检测程序。全基因组辐射杂种作图在人类基因组计划(HGP)的物理图绘制中占有十分重要的地位，是人类基因组计划的核心内容之一。目前已有现成的全基因组辐射杂种群，如编号为Genebridge4群即有93个人体DNA杂种系。辐射杂种作图对于一些缺少遗传作图资源的模式生物基因组图绘制具有重要意义：特别是牛和马这类妊娠期较长的大生物，它们的单仔生殖只能提供极有限的作图数据。其他如河豚鱼，因其繁殖困难不适宜经典遗传学分析，辐射杂种作图是一种理想的方法。许多哺乳动物，如老鼠、猪的全基因组辐射杂种作图已取得重要进展，斑马鱼以及鸡的辐射杂种作图也已展开。克隆作图基因组测序计划的准备工作之一，就是将基因组或分离的染色体打断并将这些DNA片段克隆到高容量的载体中，构建全基因组文库。这些载体是专门设计用来操作大分子的DNA，如YAC克隆平均含1～2Mb大小的DNA片段。在STS分析中，这类基因文库同样可成为作图试剂。用于物理图谱绘制的克隆文库有2种：一种是来自全基因组DNA。一种是指定的单一染色体，它们均可用于目的不同的基因组文库构建。分离单个相同染色体的仪器为流式细胞仪，其工作原理是，根据处在极度收缩状态的中期染色体所特有的形态与结构特征有区别地分检所需的成员。将细胞小心破碎后染色体可释放到缓冲液中，然后使混合的染色体与荧光染料反应。荧光物质与染色体的结合是非特异性的，结合的数量取决于染色体的大小。染色体体积越大，结合的荧光染料越多，发出荧光亮度越强。带有荧光物质的染色体经稀释后使其通过一种极细的管道，从管道下方挤出的液滴体积很小，足以保证仅含一条染色体。在液滴通过检测装置时，染色体所携带的荧光强度被记录，仪器依次根据荧光强度将相似的成员分检到同一容器中。对一些体积大小或形态相似不易区分的染色体，可改用专一性结合的染料。如人类21号染色体与22号染色体大小接近，但各自含有的AT与GC碱基比例不同。荧光染料Hoechst33258和染色素A与AT和GC结合的能力不同，这种选择性的结合赋予了染色体特征性的荧光亮度，借助这种差异很易区分21号和22号染色体。在获得基因组大分子DNA克隆文库之后，采取PCR方法检测含有STS标记的克隆，根据重叠的STS标记可绘制克隆连锁图。人类基因组遗传和物理图

20世纪80年代认为绘制详尽的人类基因组图是一项可望而不可及的任务。虽然当时果蝇和其他生物的综合遗传图已经构建，但人类家系遗传分析存在的问题及相对缺少多态性遗传标记，使遗传学家怀疑能否绘制一份含有高密度标记的人类基因组图谱。绘制人类遗传图的尝试最初始于RFLP的发现，这是动物基因组中最早被识别的多态性DNA标记。198