柠檬苦素对牛卵母细胞氧化应激水平的影响

摘要近年来，随着胚胎工程技术的深入研究和全面的商业化推广以及养牛行业的蓬勃发展，人们对于牛胚胎需求越来越大。解决这一问题的方法之一便是牛卵母细胞体外成熟。氧化应激是影响牛卵母细胞体外成熟的重要因素。为缓解氧化应激造成的不良影响，通常在培养基中添加抗氧化剂或自由基清除剂来维持卵母细胞的氧化还原平衡。本试验旨在探究在牛卵母细胞体外发育过程中添加柠檬苦素对牛卵母细胞氧化应激水平的影响。通过对分裂率，谷胱甘肽（GSH）水平，活性氧（ROS）水平，以及四种抗氧化相关基因（SOD1、SOD3、SIRT1、SIRT3）的表达量进行分析。结果显示，对照组卵裂率显著低于Lim处理组（P<0.05）；对照组ROS水平显著高于Lim处理组（P<0.05）；对照组GSH水平显著低于Lim处理组（P<0.05）；相比于对照组柠檬苦素可以显著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表达水平（P<0.05）。综上，Lim能够有效地降低氧化应激损伤，提高牛卵母细胞体外发育能力。关键词：柠檬苦素；牛；卵母细胞；体外成熟；氧化应激目录摘要 [7]。研究表明，柠檬苦素等高度氧化的三萜类化合物的结构中羟基较少，因此具有氧化活性[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.13]。柠檬苦素的抗氧化能力在脑组织中也可以表达，试验表明柠檬苦对自然衰老大鼠的学习记忆能力有一定的改善能力[14]李林子，胡文敏，唐靓，等.柠檬苦素对自然衰老大鼠抗氧化和学习记忆能力的影响［J］．中国食品卫生杂志，2016，(01):22-27.14][9]孟鹏.金柑柠檬苦素类化合物的提取纯化、结构鉴定及生物活性研究［D］．福州:福建农林大学，2013.[10]董文博,王雪莹,杨洲.柠檬苦素的性质及其生理功能的研究进展[J].食品与发酵科技,2012,48(02):1-4.[11]TianQ，MillerEG，AhmadH，etal．Differentialinhibitionofhumancancercellproliferationbycitruslimonoids［J］．NutrCancer，2001，40(2):180-184.[12]QianP，JinHW，YangXW.NewlimonoidsfromCoptidisＲhizoma-EuodiaeFructuscouple［J］．JAsianNatProdＲes，2014，16(4):333-344.[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.[14]李林子，胡文敏，唐靓，等.柠檬苦素对自然衰老大鼠抗氧化和学习记忆能力的影响［J］．中国食品卫生杂志，2016，(01):22-27.[15]MokbelMS，HashinagaF.Evaluationoftheantioxidantactivityofextractsfrombuntan(CitrusgrandisOsbeck)fruittissues［J］．FoodChem，2006，94(4):529-534.1.3研究的目的和意义胚胎移植技术是人工授精技术后的又一次重大突破，对动物科学研究以及畜牧业都是具有重大意义的伟大提升。而胚胎移植的效果取决与卵母细胞体外成熟的质量。体外培养过程中，会有许多应激损伤损害卵母细胞，氧化应激是其中最大也是最常见的一种威胁。本研究中，在牛卵母细胞体外成熟培养体系中把柠檬苦素作为抗氧化剂添加，通过分析柠檬苦素影响氧化应激水平的效果，来探究添加柠檬苦素对牛卵母细胞体外成熟过程中的发育质量的影响，为卵母细胞体外培养体系的优化，胚胎移植效率的提高提供理论依据和数据支持。第二章材料与方法2.1试验药品与仪器2.1.1试验主要仪器仪器型号 公司超净工作台SW-CJ-2FDTELSTAR二氧化碳培养箱CO170S-230-0000ASTEC高温灭菌锅MJ-54ASTIK高速离心机D3024Thermo烘干箱BAO-80ASTIK荧光显微镜C-SHG1NIKON电热恒温水浴锅XMTD203Thermo电子天平AS220.R2RADWAG实体显微镜SZ61NIKON涡旋混合器STD-09022TThermo﹣80℃冰箱ULTS1368Thermo磁力加热搅拌器1522031ESCOPCR仪Mx3000/5PBIORAD2.1.2试验药品主要试验药品试剂中文名英文名或缩写公司柠檬苦素LimoninSigma双抗P-SSigma胎牛血清FBSGibco组织培养液TCM-199Sigma体外受精液IVF100Sigma表皮生长因子EGFSigma氯化钠NaClSigma雌二醇E2Sigma丙酮酸钠PySigma碳酸氢钠NaHCO3Sigma氯化钙CaCl2Sigma磷酸二氢钠NaH2PO4Sigma卵泡刺激素FSHSigma半胱氨酸CySigma葡萄糖GlucoseSigma氯化钾KClSigma六水氯化镁MgCl2·6H2OSigma牛血清白蛋白BSASigma肝素HeparinSigma4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPESSigma庆大霉素GentamycinSigma非必需氨基酸MEMSigma谷氨酰胺L-glutamineSigma咖啡因CaffeineSigma必需氨基酸BMESigmaL（+）-乳酸L(+)-LactateSigma透明质酸酶HySigma矿物油MineralOilSigma

2.1.3药品配制试验所用药品全程在超净工作上使用去离子水完成配置，培养液PH值均在7.3-7.4之间，配制完成后使用0.22µm的过滤器过滤。1%BSA-PBS：取BSA0.4g，加入到40mlPBS溶液中，震荡溶解后过滤。在4℃保存备用。1%Hy酸酶浓缩液：取Hy0.2g，加入到20mlTCM-199中，震荡溶解后过滤。在-20℃保存备用。无菌生理盐水：取NaCl9g，青霉素500µl，链霉素500µl，加入到1L蒸馏水中，震荡溶解。常温保存备用。IVF100：分装后4℃保存备用。 早期胚胎培养液（IVC）成分见下表名称英文缩写浓度氯化钾KCl0.2300mg/ml氯化钠NaCl6.7000mg/ml牛血清白蛋白BSA4.0000mg/ml碳酸氢钠NaHCO32.2000mg/ml庆大霉素Gentamycin0.0500mg/ml谷氨酰胺L-glutamine0.1500mg/ml必需氨基酸BME2%L（+）-乳酸L(+)-Lactate0.5500mg/ml非必需氨基酸MEM1%丙酮酸钠Na-pyruate0.0400mg/ml牛卵母细胞体外成熟（IVM）培养液成分见下表名称英文缩写浓度培养液TCM-19950ml表皮生长因子EGF10ng/ml胎牛血清FBS10%双抗P-S1%卵泡刺激素FSH0.04mg/ml丙酮酸钠Py0.022g/ml雌二醇E21mg/ml精子激活液（BO）成分见下表名称英文缩写浓度氯化钠NaCl6.6300mg/ml氯化钾KCl0.2996mg/ml氯化钙CaCl20.2506mg/ml葡萄糖Glucose2.5050mg/ml牛血清白蛋白BSA5.0000mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES2.9786mg/ml碳酸氢钠NaHCO32.1000mg/ml磷酸二氢钠NaH2PO40.1178mg/ml六水合氯化镁MgCl2·6H2O0.1055mg/ml咖啡因Caffeine3.8840mg/ml丙酮酸钠Na-pyruate0.1300mg/ml肝素Heparin0.0100mg/ml2.2卵母细胞的来源在屠宰场等待母牛宰杀后，迅速将卵巢取下，使用30-35℃的无菌生理盐水进行冲洗。冲洗干净后装入保温瓶中，浸泡在30-35摄氏度的无菌生理盐水在1h内带回实验室。到达实验室后先将手和卵巢消毒，将卵巢多余的肉在超净工作台上割除。在卵巢表面用吸水纸擦拭，然后使用装有18号针头的5毫升注射器抽取卵巢上表面直径为2-8毫米的卵泡。离心管中加入抽取的卵泡液，室温下沉淀10min后将上清液弃除，将3mlB-IVM培养液加入沉淀物中。在显微镜下挑选形态正常且卵丘细胞层致密的卵子。2.3卵母细胞的体外成熟培养在挑选完成后，随机将卵子分为实验组和对照组。实验组培养滴中加入20μM柠檬苦素，未添加柠檬苦素的为对照组。将实验组和对照组在无菌培养箱中用38℃，5%CO2的条件下培养24h。2.4卵母细胞体外受精在柠檬苦素组和对照组的IVM中分别加入200µL的0.5%透明质酸酶（Hy），轻轻吹打5次以达成去除部分卵丘细胞的目的，在体外受精液（IVF100）中将卵母细胞清洗5次后放入100µLIVF100中使用矿物油覆盖；将精子从液氮内取出，在38℃水浴锅中解冻5s。在BO中加入解冻的精子，25℃，1000rpm离心5min后将上清液弃除，加入BO再离心一次。将卵母细胞与离心后沉淀的精子放入IVF100中，在5%CO2，38.5℃二氧化碳培养箱共培养6h。 2.5卵母细胞的胚胎培养受精结束后，在1.5mL容量的离心管中注入1mL的0.1%透明质酸酶，其中放置拣出的卵母细胞。为去除全部卵丘细胞，使用1000µL枪吹打30次。在含有0.4%的BSA-CRI培养基中清洗受精卵5次后放入10µLBSA-CRI中并用矿物油覆盖。放入38.5℃，5%CO2的培养箱中培养24h后检查分裂率。2.6 卵母细胞ROS水平的检测与试验操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，将裸卵放置在200μL浓度为10μmol/L细胞追踪绿色荧光染料H2DCFDA中。随后实验避光操作，在37℃恒温板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在荧光显微镜下使用绿色荧光进行观察并拍摄。2.7卵母细胞GSH水平的检测与试验操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，将裸卵放置在200μL浓度为10μmol/L细胞追踪蓝色荧光染料CMF2HC中。随后实验避光操作，在37℃恒温板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在荧光显微镜下使用蓝色荧光进行观察并拍摄。 2.8实时荧光定量PCR与试验操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，在50μL裂解缓冲液中放入裸卵进行裂解。随后在冰上开始严格无菌操作，根据说明书使用DynaBeadsmRNADirectKit（Cat#61012,DynalAsa,Oslo,Norway）试剂盒提取mRNA。接下来使用DynaBeadsmRNADirectKit（LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA）试剂盒将提好的mRNA逆转录38min获得cDNA。再使用KAPASYBR®FAST试剂盒进行qRT-PCR，PCR反应采用20µl体系。qPCR反应使用CFXConnectOpticsModulePCR仪，预变性95℃3min，95°C3s，60°C30s，72°C20s，扩增目的基因为40个循环。使用内参为GAPDH，目的基因为SOD1、SOD3、SIRT1、SIRT3。PCR引物序列如表所示，RNA的定量数据使用2−ΔΔCt方法进行统计分析。基因Gene引物序列Primersequences(5'-3')SOD1F:ATCCACTTCGAGGCAAAGGGR:TGTCACATTGCCCAGGTCTCSOD3F:TTGCGATTTTATAGGGTCGTAR:AACGCCCGAACTAAAACGATSIRT1F:TGGCCAGCTAGACTTGCAAAR:AACTTGGACTCTGGCACGTTSIRT3F:CACAGTCTGCCAAAGACCCTR:AGAACACAATGTCGGGCTTCGAPDHF:GCACCACTGGCATTGTCATGR:CCATCTCCTGCTCGAAGTCC2.9数据统计分析荧光强度分析使用Image-J软件。数据统计分析使用SPSS18.0软件，试验组与对照组使用独立样本T检验，形成表图使用GraphPadPrism6.01软件。肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P>0.05）；肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。 第三章结果3.1柠檬苦素对牛卵母细胞体外成熟的影响为了探究柠檬苦素对牛胚胎发育的影响，在试验组添加柠檬苦素20μM，普通培养基作为对照组。经过体外成熟，受精和培养，统计早期胚胎的分裂率。如图3.1所示，经过柠檬苦素处理的实验组分裂率显著高于对照组（P<0.05）。说明柠檬苦素对胚胎发育有着促进作用。图3.1柠檬苦素对牛卵母细胞发育的影响（A）24h卵母细胞分裂情况，标尺：200µm；（B）分裂率，R=3；不同字母表示统计学的显著差异（P<0.05）Fig.3.1effectofLimoninonbovineoocytedevelopment(a)24hoocytedivision，Scalebar:200µm；(b)divisionrate,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.2活性氧（ROS）荧光强度分析 为了探究柠檬苦素对牛卵母细胞内氧化应激的影响，将柠檬苦素添加到IVM培养液中培养24h后，检测卵母细胞内ROS的水平。在ROS荧光强度分析中，颜色越明亮则ROS相对水平越高。由图3.2可知，对照组ROS水平显著高于Lim处理组（P<0.05）。由此可知柠檬苦素对早期胚胎培养过程中的活性氧（ROS）具有一定的清除能力。图3.2柠檬苦素对牛卵母细胞ROS水平的影响。（A）ROS荧光染色图片，标尺：200µm（B）ROS相对水平，R=3；不同字母表示统计学的显著差异（P<0.05）Fig.3.2effectofLimoninonROSlevelofbovineoocytes.(A)ROSfluorescencestainingpictureScalebar:200µm；(b)relativelevelofROS,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.3谷胱甘肽（GSH）荧光强度分析为了进一步探究柠檬苦素对牛卵母细胞内氧化应激的影响，将柠檬苦素添加到IVM培养液中培养24h后，检测卵母细胞内GSH的水平。在GSH荧光分析中，颜色越明亮则GSH相对水平越高。由图3.3可知，对照组GSH水平显著低于Lim处理组（P<0.05）。由此可知柠檬苦素可以显著提高早期胚胎发育过程中谷胱甘肽（GSH）的相对水平。图3.3柠檬苦素对牛卵母细胞GSH水平的影响。（A）GSH荧光染色图片，标尺：200µm（B）GSH相对水平，R=3；不同字母表示统计学的显著差异（P<0.05）Fig.3.3effectofLimoninonGSHlevelofbovineoocytes.(A)GSHfluorescencestainingpicture，Scalebar:200µm(b)GSHrelativelevel,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.4抗氧化相关基因mRNA表达量为了深入探究柠檬苦素对牛卵母细胞内氧化应激的影响，将柠檬苦素添加到IVM培养液中培养24h后，检测了卵母细胞中抗氧化相关基因的表达水平:SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3。相比于对照组柠檬苦素可以显著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表达水平（P<0.05）。图3.4柠檬苦素对牛卵母细胞抗氧化相关基因的影响。RT-PCR分析抗氧化相关基因SOD1、SOD3、SIRT2和SIRT3的mRNA水平，R=3；不同字母表示统计学的显著差异（P<0.05）。Fig.2.2.6effectofLIMonantioxidantrelatedgenesinbovineoocytes.ThemRNAlevelsofantioxidantrelatedgenesSOD1,SOD3,sirt2andSIRT3wereanalyzedbyRT-PCR,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05).第四章讨论柠檬苦素是在柑橘的皮和种子中含量丰富的一种氧化性四环三萜类有机物。经过大量试验验证，具有优秀的抑菌效果和抗氧化能力。本试验探讨了在添加抗氧化剂柠檬苦素后对牛卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响。结果表明柠檬苦素能够使ROS水平降低，使GSH水平和抗氧化相关基因的表达提高，以此降低氧化应激对牛卵母细胞和胚胎的不利影响。4.1柠檬苦素对分裂率的影响分裂率是评估卵母细胞质量的标准之一。也是评判对卵母细胞发育发育是否有影响最直接的指标。在本试验中，添加柠檬苦素可以显著增加早期胚胎的分裂率。说明柠檬苦素对卵母细胞的发育具有积极的促进作用。4.2柠檬苦素对氧化应激的作用比起体内成熟，卵母细胞的体外成熟效率显著偏低，氧化应激是可能的一个原因[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.。ROS对哺乳动物的卵母细胞以及胚胎的影响非常明显，DNA在受到氧化应激造成的损伤后有可能会发生DNA断裂、基因突变以及双螺旋结构热稳定性的改变等影响，同时自由基还会对卵母细胞和胚胎的蛋白质分子中的氨基酸成分造成损害，而且蛋白质在经过氧化后，热动力学稳定性上也会变差，其中的部分三级结构会被打开，失去原有构像后蛋白质活性也会降低甚至失活[17]张申,卫涛涛.生物大分子的氧化损伤与疾病[J].怀化医专学报,2006,5(1):81-84.。因此，卵母细胞正常发育的前提是确保ROS和抗氧化水平之间的动态平衡。本试验中观察到添加柠檬苦素可以[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.[17]张申,卫涛涛.生物大分子的氧化损伤与疾病[J].怀化医专学报,2006,5(1):81-84.谷胱甘肽（GSH）是一种由甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸组成的三肽[18]冮洁,单立峰.谷胱甘肽的制备及其应用[J].饲料工业,2007(15):15-17.。GSH在细胞内在多种有氧气参与的反应中均发挥重要作用，在氧自由基发生积累时，氧自由基会与GSH的巯基相结合，氧自由基在GSH的催化下会被还原为酸性物质，以此减少氧自由基的积累，使器官免受来自氧自由基的伤害[19]代涛,尹志峰,王良友.还原型谷胱甘肽临床应用研究进展[J].承德医学院学报,2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.。GSH的主要功能是及时将氧自由基催化，减少ROS的积累[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordström,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.。具有抗氧化特性的物质在卵母细胞体外培养过程中可增加细胞内GSH的产生来防止氧化应激造成的线粒体功能障碍和氧化损伤[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.。在本试验中，柠檬苦素提高GSH的水平[18]冮洁,单立峰.谷胱甘肽的制备及其应用[J].饲料工业,2007(15):15-17.[19]代涛,尹志峰,王良友.还原型谷胱甘肽临床应用研究进展[J].承德医学院学报,2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordström,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.超氧化物歧化酶（SOD）是一种可以有效减少细胞内氧自由基积累的抗氧化金属酶[22]石慧.半滑舌鳎对纳米锌、纳米铜需求量的研究[D].天津农学院,2016.。氧自由基会在SOD的催化发生歧化，生成过氧化氢和氧，因此它能抵抗氧毒性,增强机体抵抗辐射的能力,延缓衰老，在卵母细胞体外成熟培养中的氧化与抗氧化的平衡中有着非常关键的影响[23]杨卫健,张双全.超氧化物歧化酶的研究及应用前景[J].淮阴师范学院学报(自然科学版),2002(04):82-86.DOI:10.16119/ki.issn1671-6876.2002.04.021.。作为SOD基因家族的一员，SOD1是一种在细胞中分布广泛的抗氧化酶[24]Yuewei,Sheng,Abreu,etal.SuperoxideDismutasesandSuperoxideReductases.[J].ChemicalReviews,2014.。SOD1可以结合ROS和氧气直接在能量代谢中发挥作用[25]ReddiA,

CulottaV.SOD1IntegratesSignalsfromOxygenandGlucosetoRepressRespiration[J].Cell,2013,152(1-2):224-235.，作为核转录因子时可以对氧化应激进行调控[26]TsangCK,LiuY,ThomasJ,etal.Superoxidedismutase1actsasanucleartranscriptionfactortoregulateoxidativestressresistance.NatCommun.2014Mar19;5:3446.。细胞外过氧化物歧化酶的编码基因是SOD3基因。SOD3作为SOD基因家族中的一员，和其他SOD基因相同，可以减少体内在代谢过程中所产生的活性氧（ROS）的积累，防止细胞被环境中超氧离子损伤。SOD3是SOD基因家族中唯一能在细胞外表达的基因，所以SOD3有着降低氧自由基对脉管系统造成损伤的重要作用[27]张宝,周玫,陈瑗.细胞外超氧化物歧化酶(EcSOD)[J].医学综述,2000(08):340-341.。Sirtuin蛋白是一组组蛋白去乙酰化酶，可以对很多底物蛋白质的表达、稳定性与活性通过去乙酰化作用进行调控[28]霍晓芳,张俊武.Sirtuin:依赖NAD~+的去乙酰化酶[J].生命的化学,2005(03):181-184.。Sirtuin家族基因与细胞老化，细