T-ZNZ 244-2024 动物源性产品中羊源性成分检测数字PCR 法

ICS67.120.10CCSB45T/ZNZ浙江省农产品质量安全学会发布IT/ZNZ244—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省农业科学院、天津市农业科学院、迈克生物股份有限公司。本文件主要起草人：陈笑芸、纪艺、赵新、付军、彭城、王晓雪、汪小福、徐俊锋。IT/ZNZ244—20241T/ZNZ244—2024动物源性产品中羊源性成分检测数字PCR法本文件描述了使用数字PCR检测方法测定动物源性产品中山羊、绵羊等DNA成分的原理、试剂与材料、仪器和设备、试验步骤、结果分析与表述、定量限和检出限。本文件适用于肉及其加工品、动物源性饲料中山羊、绵羊等DNA成分的数字PCR定性和定量检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。农业部2406号公告-7-2016转基因动物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1数字PCRdigitalPCR一种核酸绝对定量的PCR技术。将PCR体系分配成大量微反应体系进行PCR扩增，扩增后对微反应体系进行荧光信号阅读，通过阳性率和泊松分布计算获得样品中靶序列拷贝数浓度。4原理本文件针对羊种属特异序列设计选取特异性引物和探针进行数字PCR扩增，根据荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果，依据微反应体系的阴、阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的羊种属特异性基因拷贝数浓度。5试剂与材料除非另有说明，所有试验用试剂均为分析纯，水为无DNase/RNase超纯水。5.1基因组DNA提取或动物成分相关DNA提取试剂盒按照农业部2406号公告-7-2016中4执行或采用等效的动物成分DNA提取试剂盒。5.2数字PCR反应试剂盒2T/ZNZ244—2024按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒。5.3羊种属特异性序列引物/探针（锌指解旋酶基因，HELZ基因）HELZ-F:5′-AGGTTGCGCCATGCTGTAG-3′HELZ-R:5′-CAGGACTTCTAATTTCGCCAGTAAC-3′HELZ-P:5′-AGGAGGAATCCCCATCATCACGGC-3′6仪器和设备6.1数字PCR系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、PCR扩增仪（变温速率≤2℃/s，孔间温度差异<1.0℃)和微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能仪器的系统。6.2生物安全柜或超净工作台。6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4电子天平：感量0.1g。6.5离心机：离心力12000g。6.6微量移液器。6.7涡旋震荡仪。7试验步骤7.1试样制备7.1.1对样品进行前处理处理后将样品分成三等份，包括待检样品、复检样品和留存样品。7.1.2固体样品依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次~3次后，置于50mL离心管或密封袋中，-20℃以下冻存。7.1.3半固体和液体样品混匀后直接分装到50mL离心管或密封袋中，-20℃以下冻存。7.2DNA模板制备7.2.1试剂盒按照农业部2406号公告-7-2016中6.3执行或等效采用DNA提取试剂盒提取DNA。7.2.2DNA浓度和纯度的测定遵照农业部2406号公告-7-2016中6.4规定执行。7.3数字PCR扩增3T/ZNZ244—20247.3.1对照以含有羊源性成分的样品作为阳性对照（建议优先选用有证标准样品或有证标准物质以不含有羊源性成分的样品作为阴性对照，用等体积无菌水代替模板DNA作为空白对照。同时进行对照和试样的数字PCR反应，试样设置6次重复，对羊源性特异基因进行扩增，以定量值的均值作为最终结果。各对照PCR反应体系中，除模板外，反应体系和反应条件与7.3.2和7.3.3相同。7.3.2数字PCR反应体系对样本进行PCR反应。数字PCR反应中的羊种属特异性基因按表1在PCR反应管中加入反应试剂，涡旋混匀。表1羊种属特异性基因数字PCR反应体系—10µmol/LHELZ-F10µmol/LHELZ-R10µmol/LHELZ-P注2：推荐市面上现售的数字PCR平台进行试验，并针对市面上现售的不同数字PCR平台，依据说明书调整反应7.3.3反应程序1min98℃,10min；4℃保存。不同PCR反应平台可根据说明书对热启动步骤程序进行修改，但不能对热循环（扩增程序）进行修改。扩增结束后读取荧光信号，用于后续数据分析。8结果分析与表述8.1质量控制数字PCR扩增结果，阴性对照组和空白对照组均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，且核酸拷贝数浓度大于6copies/μL，则试验成立。8.2阈值设定数字PCR结果中，阴性微滴和阳性微滴明显分开，阈值设在阴性微滴和阳性微滴分开的区域。8.3拷贝数计算数字PCR仪运行后经软件计算得出每个试样羊种属特异性基因拷贝数浓度。每份试样6个重复，4T/ZNZ244—2024共6个数据的相对标准偏差不超过25%时，将6个检测结果的平均值作为样品的检测结果，单位为拷8.4检测结果表述阴性对照、阳性对照和空白对照检测结果符合8.1要求的情况下，分析试样结果：——试样检测出HELZ基因阳性微滴，且核酸拷贝数浓度≥6copies/μL，则判定为阳性。表述为“样品中检出羊源性成分，检出XXcopies/μL”。——若样品中检测出HELZ基因阳性微滴，且核酸拷贝数浓度＜6copies/μL，则需复检。若复检结果仍检测出阳性微滴，则判定为阳性，否则判定为阴性。若阳性表述为“样品中检出羊源性成分”，若阴性表述为“样品中未检出羊源性成分”。——若样品中未检测出HELZ基因阳性微滴，则判定为阴性。表述为“样品中未检出羊源性成分”。9定量限和检出限定量限为11copies/μL；检出限为6copies/μL（指在数字P