pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽

艹艹艹艹艹艹艹艹生物技术进展生物技术进展2023年第13卷第6期934~939CurrentBiotechnologyISSN2095‑2341艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹艹pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽王珍瑜1，陆文超1，钟康荣2，关永健2，汪真2，陈超1*1.清华大学化学系，北京100084；2.贵州千鲟生物科技有限公司，贵州黔东南苗族侗族自治州556300摘要：pH渐变条件下采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分步连续酶解鲟鱼软骨，同时制备鲟鱼硫酸软骨素和胶原蛋白肽。分别通过温度、酶解时间、酶用量3个单因素实验，研究其对连续酶解效果的影响。综合分析得出最佳条酶用量为50U·g-1底物；菠萝蛋白酶的酶解温度为50℃,酶解时间为2h，酶用量为30U·g-1底物。该工艺条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。研究建立的pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺，产率与纯度较国内现有生产方法均有提高，且碱液使用量减少，避免了有机溶剂的引入，从而可以降低生产成本，减轻环境污染负担。中图分类号：Q556，TQ925+.2文献标byMulti-enzymeStep-by-stepEnzymaticHydrolysisUndertheConditionofpHGradientWANGZhenyu1，LUWenchao1，ZHONGKangrong2，GUANYongjian2，WANGZhen2，CHENChao1*dosagewas100U·g-1andenzymedosagewas30U·g-1基金项目：清华大学国强研究院项目。 王珍瑜，等：pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽935鲟鱼，又名鲟龙，隶属于硬骨鱼纲辐鳍亚纲硬鳞总目鲟形目，是地球上最原始和最古老的软骨鱼种之一，也是淡水鱼中寿命最长、个体最大的鱼类［1］。近年来，我国开展了鲟鱼养殖，目前，我国已成为世界鲟鱼养殖第一大国，其中史氏鲟头、脊索、鳍中软骨占鱼体质量的10％左右。软骨中含有丰富的硫酸软骨素和胶原蛋白，具有很高的营养价值和较强的保健功能，素有“鲨鱼性粘多糖，结构复杂，主要以与蛋白质结合的蛋白聚糖形式存在［4-5］。硫酸软骨素作为一种天然的活性成分在医药领域有着广泛的应用前景［6-7探索并开发硫酸软骨素具有重要的经济与社会价值［8-10］。波法、乙酸抽提法和酶解法等［11-12］。常用的硫酸软骨素提取方法一般需要使用大量的碱液和有机溶剂，提取率相对也比较低。Ⅱ型胶原蛋白是鲟鱼软骨中的主要蛋白，其由3个分子量约为110kD的α链组成。鲟鱼软骨中的胶原蛋白也具有一定的营养价值，但由于其分子量太大且具有三螺旋结构，不易被快速消化吸收，其功效与价值很难被化吸收率会得到明显提高［13］。近年来，研究者也加大了对胶原蛋白肽的提取、分离、纯化工艺的研究［14-16进而对其生理作用进行探究［17-18］。本研究在pH渐变条件下用多酶连续分步酶解工艺，采用单因素试验法考察了酶用量、酶解时间、酶解温度3个因素对酶解效果的影响。酶解后利用超滤分离即可得到纯度较高的硫酸软骨素和胶原蛋白肽，期望为今后用鲟鱼软骨生产硫酸软骨素和胶原蛋白肽提供了工艺依据。1材料与方法供；木瓜蛋白酶240U·mg-1、碱性蛋白酶100U·mg-1、菠萝蛋白酶100U·mg-1均购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司；硫酸软骨素标准品购自上海阿拉丁生化科技有限公司；盐酸氨基葡萄糖对照品购自Sigma公司；对二甲氨基苯甲醛、乙酰丙岛津LC-16液相色谱仪；PL203型电子天平（梅特勒-托利仪器（上海）有限公司岛津UV-2600i紫外分光光度计；TYM-8电热恒温水浴锅（中国济南天宇专用设备有限公司高速粉碎机（TP-1000C-8，宁波新芝生物科技股份有限公司台式高速冷冻离心机（TGL-16M，长沙易达仪器有限公司真空冷冻干燥机（FD-5，上海能共实业有限公司）。骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，用绞碎，放入水中搅拌，然后过筛清洗，以除1.2.2酶解法提取硫酸软骨素与胶原蛋白肽鲟鱼软骨称重，加软骨5倍重量的去离子水，用胶体至25℃,加碳酸钠调pH至8.5。先加入碱性蛋白酶，控温酶解一段时间（按单因素实验梯度设置进单因素实验梯度设置进行然后加入菠萝蛋白酶，控温酶解一段时间（按单因素实验梯度设置进的中空纤维膜超滤，截留部分冷冻干燥后得到鲟鱼硫酸软骨素，透过液冷冻干燥后得到胶原蛋白式中，Y为提取率，C1为产物中目标物的含为原料质量。1.2.3单因素实验实验条件和梯度范围对酶解温度、酶解时间和酶用量分别进行单因素实验，碱55、60℃);碱性蛋白酶酶解时间选取6个水平·g-1木瓜蛋白酶936生物技术进展CurrentBiotechnology93670、80U·g-1菠萝蛋白酶酶解温度选取6个水平);菠萝蛋白酶酶解时间·g-11.2.4硫酸软骨素含量检测硫酸软骨素含量参照GB/T20365-2006硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定方法并采用液相色谱法进行含量测定。色谱柱：C18（250mm×4.6nm，5µm流动等度洗脱，流速0.8mL·min-1，检测波长为192nm，柱温为30℃,进样量为10µL。1.2.5胶原蛋白肽含量检测胶原蛋白肽含量检测参照GB/T5009.5-2003中的方法测定。蛋白质的换算系数为6.25。称取充分混匀的固体试样0.2~2.0g（约当于30~40mg氮精确至0.001g，至消化管中，再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50mL水，于自动凯氏定氮仪（使用前加入氢氧化钠溶液，盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A或B的硼酸溶液）上实现自动1.2.6蛋白分子量范围检测蛋白分子量范围检测按GB31645-2018附录A方法检测。色谱柱：TSKgelG2000SWXL（300mm×7.8nm流动相：乙度洗脱，流速0.5mL·min-1，检测波长为1220nm，柱温为30℃,进样量为10µL。2结果与分析2.1碱性蛋白酶酶解条件的单因素实验分析2.1.1酶解温度对酶解效果的影响在碱性蛋白酶用量为200U·g-1底物，酶解时间为6h，以酶解后的蛋白分子量范围为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，结果如图1所示。升高温度有利于酶解，当温度为45℃时酶解效果最好，温度继续增加对酶解效果的改善有限，因此，综合考虑选取酶解温度45℃进行优化试验。2.1.2酶解时间对酶解效果的影响在碱性蛋白酶用量为200U·g-1底物，酶解温度为45℃,以酶解后的蛋白分子量范围为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，结果如图2所示。当酶解时间超分子量小于10000Da蛋白占比/%图1酶解温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响图2酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响2.1.3酶用量对酶解效果的影响在酶解温度为45℃,酶解时间为2h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察碱性蛋白酶用量对酶解效果的影响，其结果如图3所示。酶用量在100U·g-1以下时，随着酶用量的增大，酶解效果逐渐提高，之后分子量小于10000Da蛋白占比/%4005010015酶用量/(U·g)图3酶用量对碱性蛋白酶酶解效果的影响 王珍瑜，等：pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽937再增大酶用量对酶解效果影响很小。综合考虑，选择酶用量为100U·g-1作为最佳酶用量条件。2.2木瓜蛋白酶酶解条件的单因素实验分析以碱性蛋白酶酶解后（酶用量100U·g-1底物，通过改变酶解温度、酶解时间和酶用量3个单因素来研究木瓜蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响。2.2.1酶解温度对酶解效果的影响在木瓜蛋白酶用量为50U·g-1底物，酶解时间为6h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，其结果如图4所示。随着温度的增加，酶解效率呈先增大后减小的趋势，当温度达到进行优化实验。分子量小于10000Da蛋白占比/%图4酶解温度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响2.2.2酶解时间对酶解效果的影响在木瓜蛋白酶用量为50U·g-1底物，酶解温度为50℃,以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，其结果如图5所示。当酶解时间为2h比达到79%，随着时间的增加，结果在79%上下浮2.2.3酶用量对酶解效果的影响在酶解温度为50℃,酶解时间为2h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察木瓜蛋白酶用量对酶解效果的影响，结果如图6所示。当酶用量达到50U·g-1，再增加酶的用量对酶解效果的提高很小，因此选择酶用量为50U·g-1作为最佳酶用量条件。分子量小于10000Da蛋白占比/%858580757065602030405060708090酶用量/(U·g)图6酶用量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响2.3菠萝蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后（碱性蛋白酶用量100U·g-1底物，酶解时间2h，酶解温度45℃;木瓜蛋白酶用量50U·g-1底物，酶解时间2h，酶解温度50℃)的液体为原料，分别通过改变酶解温度、酶解时间和酶用量3个单因素来研究菠萝蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响。2.3.1酶解温度对酶解效果的影响在菠萝蛋白酶用量为30U·g-1底物，酶解时间为6h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，其结果如图7所示。随着温度的增加，酶解效率呈先增大后减小的趋势，当温度达到8585807570656001234567时间/h图5酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响分子量小于10000Da蛋白占比/%图7酶解温度对菠萝蛋白酶酶解效果的影响938生物技术进展CurrentBiotechnology9382.3.2酶解时间对酶解效果的影响在菠萝蛋白酶用量为30U·g-1底物，酶解温度为50℃,以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，结果如图8所示。随着酶解时间的延长，酶解效果总体上呈升高的趋势，考虑到2h与6h时的效果仅相差2%，综合考虑后选择酶解时间为2h进行优化实验。分子量小于10000Da蛋白占比/%90908886848280时间/h图8酶解时间对菠萝蛋白酶酶解效果的影响2.3.3酶用量对酶解效果的影响在酶解温度为50℃,酶解时间为2h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察菠萝蛋白酶用量对酶解效果的影响，结果如图9所示。当酶用量为30U·g-1时，酶解效果最好，分子量小于10000Da的蛋白占比达到89%，随着酶用量的增加，酶解效果变化不明显，因此，选择酶用量以30U·g-1作为最佳条件。分子量小于10000Da蛋白占比/%酶用量/(U·g)图9酶用量对菠萝蛋白酶酶解效果的影响综合考虑单因素实验得到的最佳工艺参数及操作的可行性，确定连续分步酶解工艺制备硫酸软骨素与胶原蛋白肽的最佳工艺参数为：碱性蛋白酶用量为100U·g-1底物，酶解温度45℃,酶解时间2h；木瓜蛋白酶用量为50U·g-1底物，酶解温度50℃,酶解时间2h；菠萝蛋白酶用量为30U·g-1底物，酶解温度50℃,酶解时间2h。最佳条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。3讨论本研究以养殖鲟鱼软骨为原料，用pH渐变条件下多酶连续分步酶解工艺，可实现同时制备高纯度的鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽。最佳条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。鲟鱼软骨中含有丰富的硫酸软骨素和胶原蛋白，具有很高的应用价值。传统方法提取硫酸软骨素一般需采用大量的碱液和有机溶剂，提取率相对较低。因此，对现有方法进行改良十分必要。周畅等［19］利用响应面方法优化鳐鱼硫酸软骨素提纯工艺，结果表明，最优提取工艺为碱液浓度骨素提取率为43.32%。与之相比，本文制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，本工艺大大提高了硫酸软骨素的提取率。胡艺等［20］通过酸溶-胃蛋白酶从鲟鱼软骨中提取的胶原蛋白，相对于加入NaOH浸泡去除非胶原成分、灭酶活以及加入冰醋酸透析，本文则减少了碱液使用量、且不需要有机溶剂的参与。综上，本试验为鲟鱼养殖及其副产物的加工提供了一条新的路径，与现有生产工艺相比，操作简单，减少了碱液使用量且不需要有机溶剂