第十三章-可见分光光度法和紫外分光光度法

第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法第一节物质的吸收光谱第二节分光光度法基本原理第三节可见分光光度法

分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种，本章着重介绍可见分光光度法。与滴定分析方法相比，分光光度法是灵敏度高、被测物质浓度的下限可达10－5至10－6mol·L-1，因而适用于微量及痕量成分的测定，是当前医药、卫生、环保、化工等部门常用的分析方法之一。第一节物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收二、物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收

当一束光照射在某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与光子作用，光子的能量发生转移，使低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态，这个过程即是物质对光的吸收。M（基态）＋h۷M*（激发态）

不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长不同。光的能量与波长成反比，波长越短，能量越高。

单一波长的光称为单色光，由不同波长组成的光称为复色光。白光（日光等）就是一种复色光，它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光按一定的强度比例混合而成。若两种颜色的光按照适当的强度比例混合可成白光，则这两种光称为互补色光。处于同一直线上的两种色光为互补光，见下图：从图中可以看到，蓝光与黄光互补，青光与红光互补等物质呈现的颜色吸收光颜色波长范围（nm)黄绿紫380－435黄蓝435－480橙黄绿蓝480－500红紫绿500－560紫黄绿560－580蓝黄580－595绿蓝橙595－650蓝绿红650－760

物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。

如CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色光，故CuSO4溶液呈蓝色。

[Fe(SCN)6]3-呈血红色，说明其溶液选择性地吸收白光中的青色光。如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈黑色。二、物质的吸收光谱吸光度（A）：测量溶液对不同波长的单色光的吸收程度。吸收曲线（或吸收光谱）：以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，此曲线就是吸收曲线（或吸收光谱）以三（邻二氮菲）合铁（II）离子的吸收光谱图为例，看看它的吸收光谱：（1）、（2）（3）、（4）的浓度逐渐增大从吸收光谱图中看出，不同浓度的吸收光谱，形状基本一致，最大吸收波长都相同；还可以看到溶液浓度不同，吸收光谱的峰值越高，两者成正比关系。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。吸收光谱体现了物质的特性，是进行定性、定量分析的基础。是定性分析的依据，溶液浓度越大，则吸光度A越大，是进行定量分析的依据。第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度二、Lambert-Beer定律三偏离Lambert-Beer定律的原因一、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面反射。设入射光强度为I0,吸收光强度为，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则：

在分光光度法中，通常将被测溶液和参比溶液分别置于两个材料和厚度的吸收池中，因此上式可简化为：透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率，用T表示：透光率越大，溶液对光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液对光的吸收越多。透光率的负对数称为吸光度，用A表示。A越大，溶液对光的吸收越多。

二、Lambert-Beer定律(1)Lambert定律适用条件：对所有的均匀介质(即低浓度溶液）都适用测定条件：在浓度一定的条件下关系式为：

b:液层厚度；k1：比例系数，它与被测物质的性质、入射光的波长、溶剂、溶液浓度及温度有关。（2）Beer定律适用条件：仅适用于单色光测定条件：在液层厚度一定的条件下关系式为：A=k2Cc:物质的量浓度；k2：它与被测物质的性质、入射光的波长、溶剂、液层厚度及温度有关。等有关的常数。（3）Lambert-Beer定律当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚度一定，则吸光度与溶液浓度成正比，并且与吸光物质种类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关，且对所有的均匀介质（即低浓度溶液）和单色光都适用。

b的单位为cm,c为物质的量浓度（mol·L-1），ε为摩尔吸光系数，单位为L·mol-1·cm-1。

若用质量浓度代替物质的量浓度c，则Lambert-Beer定律可表示为：式中为质量吸光系数，单位为L·g-1·cm-1

和可通过下式转换：表示被测物质的摩尔质量。或是通过标准物质稀溶液测得的，它的数值越大，表明溶液对入射光越容易吸收，测定的灵敏度就越高。一般值大于103即可进行分光光度法测定。由Lambert-Beer定律可知：如果溶液中存在两种或两种以上对光有吸收的物质，在同一波长下只要共存物质不互相影响，即不因共存物的存在而改变本身的吸光系数，则吸光度是各共存物质吸光度之和，即：式中A为总吸光度，Aa、Ab、Ac…..为溶液中共存物质各组分a、b、c……等的吸光度。例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为0.150mmol·L－1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8％，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε及质量吸光系数。解：由Lambert-Beer定律可得已知c=0.150×10-3mol·L－1，b=2.00cm，T=0.398代入三偏离Lambert-Beer定律的原因根据Lambert-Beer定律，以A为纵坐标，以cB或ρB为横坐标作图，应得到一条通过原点的直线。但在实际测定中，常会出现标准曲线偏离直线的现象，曲线向上或向下发生弯曲，这种现象称为偏离Lambert-Beer定律。标准曲线的偏离引起偏离Lambert-Beer定律的原因有物理因素和化学因素两大类。（一）物理因素引起的偏离1.非单色光引起的偏离假设入射光仅由波长为

和的两种单色光组成，其强度分别为I01和I02，当通过浓度为cB，厚度为d的吸光物质溶液后，透射光的强度分别为I1和I2。对波长为的单色光：对波长为的单色光：实际测定时，只能测得它们的总吸光度A总。由于总入射光强度为I01＋I02，总透射光强度为I1＋I2，故：若，则有：

即总吸光度A总与浓度cB仍服从

Lambert-Beer定律。此结论可能对应以下两种不同的情况：（1）很小，可近似认为，入射光近似为单色光，故A与cB仍成正比。（2）尽管较大，但在所选择的入射光波长范围附近吸收曲线较平坦，因此κ变化较小，故

A与cB仍保持较好的线性关系。若较大时，不等于，则A与cB

不成正比而偏离Lambert-Beer定律，与相差越大，偏离就越显著。2.非平行入射光引起的偏离若入射光束为非平行光，就不能保证光束全部垂直通过吸收池，可能导致光束通过吸收池的实际平均光程大于吸收池的厚度，使实际测得的吸光度大于理论值，从而导致与Beer定律产生正偏离。

3.介质不均匀引起的偏离若溶液中生成溶胶或发生浑浊，当入射光通过该溶液时，除一部分被吸光物质吸收外，还有一部分被溶胶粒子和粗分散粒子散射而损失，使透光率减小，实测的吸光度偏高，从而对Lambert-Beer定律产生正偏离。1.溶液浓度过高引起的偏离若吸光物质溶液的浓度较高时，吸光粒子之间的相互作用较强，改变了吸光粒子对光的吸收能力，使溶液的吸光度与溶液浓度之间的线性关系发生了偏离。2.化学反应引起的偏离

Lambert-Beer定律中的浓度是指吸光物质的平衡浓度，而在实际工作中常用吸光物质的分析浓度来代替。当吸光物质的平衡浓度等于其分析浓度或与分析浓度成正比时，A与cB的关系服从Lambert-Beer定律。（二）化学因素引起的偏离

被测吸光物质在溶液中常发生缔合、解离、互变异构、逐级配位等反应，形成新的化合物而改变了其平衡浓度与分析浓度之间的正比关系，从而导致偏离Lambert-Beer定律。第三节

可见分光光度法一、分光光度计二、测定方法三、吸光光度法分析条件的选择四、应用-铁的测定一、分光光度计光源单色光器检测器吸收池

讯号处理及显示器1、光源

可见分光光度法是以钨灯作光源。钨灯可发出320至3200nm的连续光谱，波长最适宜的波长范围为360至1000nm。2、单色光器单色光器由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成。通过转动棱镜便可在出光狭缝得到所需波长的单色光。

所以混合光从空气进入棱镜后，便按波长由长到短的顺序依次分散成为一个连续光源。单色光器的作用就是将混合光分散成一系列的单色光。3、吸收池

分光光度计中用来盛放溶液的容器称为吸收池，是用光学玻璃制成。在测定中同时配套使用的吸收池应相匹配，即有相同的厚度和相同的透光性。4、检测器可见分光光度计中的检测器一般用光电管，它是用一个阳极和一个对光敏感材料制成的阴极所组成的真空二级管，当光照射到阴极时，表面金属发射电子，流向电势较高的阳极而产生电流。光电管输出的电讯号很弱，约为1×10－6A，经放大器放大后输入指示器。指示器一般有微安电表，记录器，数字显示和打印等。透光率刻度是等分的，因吸光度与透光率是负对数关系，所以吸光度刻度是不均等的。二、测定方法（一）、标准曲线法（二）、标准对照法（一）、标准曲线法方法是：取标准品配制成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，作图，得一通过坐标原点的直线——标准曲线。然后将被测溶液置于吸收池中，在相同条件下，测量其吸光度，根据吸光度即可在标准曲线上查得其对应的含量。使用时要注意标准溶液和待测溶液在相同条件下进行测量，且溶液的浓度在标准曲线的线性范围内。00.20.40.60.811.2050100150200Aρ/(mg·L-1)

维生素B12的标准曲线

（二）标准对照法先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液（其浓度用Cs表示），在处测出吸光度，在相同条件下测出试样溶液的吸光度，则试样溶液浓度可按照下试求得：此法适用于非经常性的分析工作。三、吸光光度法分析条件的选择（一）、显色反应及其条件（二）、测定波长的选择（三）、吸光度范围的选择（四）、参比溶液的选择1、显色反应及其条件可见光区的吸光光度法只能用于测定有色溶液。对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须加入一种能与被测组分反应生成颜色较深的有色化合物的试剂，然后再进行测定。将被测组分转变成有色化合物的化学反应称为

显色反应，能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为显色剂。

显色剂必须满足下述条件：

（1）灵敏度要高：可见吸光光度法一般用于微量组分的测定，因此要求选择的显色剂能与待测组分生成摩尔吸收系数较大的有色化合物。生成的有色化合物的摩尔吸收系数越大，对入射光的吸收程度越大，测定的灵敏度就越高。（2）选择性要好：选用的显色剂最好只与待测组分发生显色反应，而与溶液中共存的其他干扰离子不显色，或者显色剂与被测组分所生成的有色化合物的颜色和显色剂与干扰离子所生成有色化合物的颜色有明显的不同。

（3）显色剂与被测组分生成的有色化合物要有足够的稳定性，不易受外界条件的影响而发生变化。（4）显色剂与被测组分生成的有色化合物的组成要恒定，符合一定的化学式，否则测定的再现性就较差。（5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足够大，一般要求相差60nm以上。2、显色条件的选择

（1）.显色剂的用量显色剂的适宜用量常通过实验确定，其方法是取7~10个相同浓度的被测组分的溶液，并固定其他条件，然后分别在溶液中加入不同量的显色剂，逐一测定吸光度，绘制吸光度A与显色剂浓度cB

的关系曲线。吸光度与显色剂用量的关系

（2）.溶液的酸度溶液的酸度对显色反应的影响主要表现在以下三个方面：①溶液的酸度对被测组分存在状态的影响：大多数被测金属离子易水解，当溶液pH增大时，可能生成各种类型的氢氧基配合物，甚至生成氢氧化物沉淀，使显色反应不能进行完全。

②溶液的酸度对显色剂的平衡浓度和颜色的影响：大多数显色剂是有机弱酸或有机弱碱，当溶液的pH变化时，将影响显色剂的平衡浓度，并影响显色反应的完全程度。另外，有一些显色剂本身就是酸碱指示剂，它们在不同pH的溶液中具有不同的结构，而产生不同的颜色，所以对显色反应也有影响。

③溶液酸度对有色化合物组成的影响：在不同pH的溶液中，显色剂与待测离子形成的有色化合物的组成往往不同，其颜色也不同。必须控制合适的pH，才能获得好的分析结果。

不同的显色反应的适宜pH是通过实验确定的。具体方法是:固定溶液中被测组分和显色剂的浓度，改变浓度的pH，测定此pH下溶液的吸光度，以pH为横坐标，以吸光度为纵坐标，作出pH与吸光度的关系曲线，从中可找出适宜的pH范围。pH与吸光度的关系曲线

(3).显色温度显色反应一般在室温下进行，但有些显色反应需要加热到一定温度时才能完成，而有些化合物当温度较高时又容易发生分解。对不同的显色反应，应通过实验找出各自的最佳温度范围。(4).显色时间通过实验来确定合适的测定时间。实验的方法是配制一份待测溶液，从加入显色剂起计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t关系曲线，根据曲线选择合适的测定时间。（二）、测定波长的选择选择溶液具有最大吸收的波长λmax作为入射波长。在λmax处最大，使测定具有较高的灵敏度；同时，在λmax处的一个较小范围内，吸光度变化较小，不会偏离Lambert-Beer定律，也使测定具有较高的准确度。如果干扰物质在λmax处也有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但应尽可能选择随波长改变而变化不大的区域内的波长。（三）、吸光度范围的选择

在吸光光度分析中，分光光度计的读数误差也是测定误差的主要来源之一。对于同一台仪器，透光率读数的绝对误差基本上为一定值。由于透光率T与试样溶液浓度cB

之间为对数关系，因而在不同的透光率读数范围内，这一恒定误差所引起的浓度cB

的测定的相对误差是不同的。

以上两式相除：上式也可改写成：

根据Lambert-Beer定律：当液层厚度d为定值时，将上式微分：不同透光率时测定浓度的相对误差ΔcB/cB(ΔT=0.01)T/%95908070605036.83020105220.610.75.64.03.32.92.72.83.24.36.513.0测定相对误差与透光率的关系

在T=36.8%（A=0.434）时，浓度测定的相对误差最小。在实际测定时，常将吸光度控制在0.2~0.7（T=20%~65%）之间，以减小浓度测定的相对误差。（四）、参比