仪器分析课件-第3章-紫外分光光度法

第三章紫外-可见分光光度法第一节概述紫外--可见光在电磁波谱中的位置γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波10-20.1nm10nm102nm103nm0.1cm100cm1cm103m|||||||

一、紫外-可见光谱二、物质对光的选择性吸收●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。●让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。●单色光：单一波长的光●复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。●光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光，

称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。基于物质吸收紫外或可见光（200～800nm)引起分子中价电子跃迁、产生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为紫外可见分光光度法（UV-vis）。三、紫外-可见分光光度法特点（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。（2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。（3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。（4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。（5）应用广泛，无机、有机物均可测定。第二节紫外-可见分光光度法的基本原理入射光强度

I0透射光强度It一束平行单色光一、透光率（透光度）和吸光度①透光率T②吸光度（吸收度）A定义：T=ItI0×100%定义：A=lg1T=-lgT=lgI0IttIaIrI0=It+Ia+Ir吸收光反射光透过光t二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系：朗伯定律：A=k1×L比尔定律：A=k1×CA=kCL

一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。②均匀、无散射溶液、固体、气体。③吸光度A具有加和性。Aa+b+c=Aa+Ab+Ac注意!适用范围朗伯-比尔定律:吸光系数浓度液层厚度三、吸光系数1、摩尔吸光系数或Em：

在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。单位：L/(mol.cm)（1）一定条件下是一个特征常数。（2）在温度和波长等条件一定时，ε仅与物质本身的性质有关，与待测物浓度c和液层厚度L无关；（3）定性和定量分析依据：同一物质在不同波长时ε值不同。不同物质在同一波长时ε值不同。εmax表明了该物质在最大吸收波长λmax处的最大吸光能力。

4、吸光系数的意义:2、百分吸光系数/比吸光系数：3、两者关系:A=kcLk=A/cL

一定λ下,c=1%(W/V)，L=1cm时的吸光度。单位：100ml/g.cm1g/100ml1．定义：以A为纵坐标，λ为横坐标，绘制的λ~A曲线。四、吸收光谱（吸收曲线）2．吸收光谱术语：①吸收峰→λmax,②吸收谷→λmin③肩峰→λsh,④末端吸收五、偏离光的吸收定律原因朗伯-比尔定律：A=kCL依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线（一）化学因素（二）光学因素

偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：该定律适用于稀溶液，溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。尤其浓度过高(>0.01mol/L)会使C与A关系偏离定律：①粒子相互作用加强，吸光能力改变。②溶液对光的折射率显著改变。（二）光学因素1．非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提。2．杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。3．反射和散色光的影响：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形。通常可用空白对比校正消除。4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形。（一）化学因素朗伯—比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；0.575第三节紫外-可见分光光度计依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波长单色光λ、浓度）光源单色器吸收池检测器信号处理及显示分光光度计外观分光光度原理图:分光光度计外观光源单色器吸收池检测器信号处理显示器721型可见分光光度计一、主要部件1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯和卤钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。氘灯—紫外卤钨灯--可见氙灯氢灯钨灯2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光;

棱镜或光栅单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同

入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便

3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。吸收池(比色皿)吸收池通常有0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm宽利用光电效应将透过吸收池的光信号变成电信号，常用的有光电池、光电管、光电倍增管或光二极管阵列。

4.检测系统

光电管

5.结果显示记录系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理记录装置二、分光光度计的类型

（一）单光束分光光度计

光源单色器参比样品检测器显示器

只有一条光路，通过变换参比池和样品池的位置，使它们分别置于光路来进行测定

国产751型、752型、721型、722型、UV-1100型、英国SP-500型

单波长分光光度计1)单光束分光光度计缺点测量结果易受光源波动性的影响，误差较大单色器

同步旋转镜单色器参比样品检测器显示器斩光器光源（二）双光束分光光度计

双光束分光光度计可自动扫描吸收光谱；自动消除光源强度变化带来的误差单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。单波长双光束分光光度计光路

一个光源，两个单色器，一个吸收池光源单色器Ⅰ单色器Ⅱ吸收池检测器

1

2斩光器用两种不同波长的单色光束交替照射到样品溶液上，不需使用参比溶液，测得的是样品在两种波长下的吸光度之差（三）双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计结构特点两个单色器不需要参比溶液第四节分析条件的选择一、测量条件的选择1.吸光度的范围：T∈20%~65%，A∈0.2～0.7之间吸收最大的波长为入射光，干扰最小2.测定波长的选择：二、参比溶液（空白溶液）的选择用于调节100%T，若选择不适当，对测量读数的影响较大。主要是消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响。1.溶剂参比液当试液、试剂、显色剂均无色时，用溶剂(通常是蒸馏水)作参比液；3.试剂参比液如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。2.试样参比液如果试样中的其他组分也有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液。4.平行操作参比液用不含待测组分的溶液，在相同条件下与待测试样同时进行处理，此为平行操作参比溶液。第五节定性与定量分析紫外-可见分光光度法主要用于有机物分析。定性分析：比较吸收光谱特征可以对纯物质进行鉴定及杂质检查；定量分析：利用光吸收定律进行分析一、定性分析1、对比吸收光谱的一致性将实验所得未知物的谱图与标准的对照，主要对比λmax，εmax以及峰数目是否一致2、用经验公式计算λmax，与实验结果对照伍德沃德规则：用于计算共轭二烯、多烯及共轭烯酮等化合物π→π*跃迁所对应的λmax斯科特规则：用于计算C6H5——COXE2带的λmax二、定量分析定量分析方法介绍①标准曲线法

也称为外标法，包括标准曲线和工作曲线。标准曲线：将标准溶液稀释成含不同浓度被测物的工作溶液，

而后直接进样。根据标准溶液中被测物浓度与测量得到的信号绘制曲线或求得回归方程。工作曲线：将标准溶液通过简单稀释制成样品溶液；或将标准溶液加入到实际空白样品中制成标加样品，然后将此样品溶液或标加样品按实际样品分析步骤，进行样品预处理，而后进行分析，根据样品中被测物的浓度与测量得到的信号绘制曲线或求得回归方程。②内标法在样品中加入内标物，内标物性质与待测物相近，且内标物浓度保持恒定，测量被测物与内标物的信号比，以此信号比相对于被测物浓度制成标准曲线或求得回归方程。③标准加入法

取几份相同的样品加入不同量的被测物标准后，进行分析，将测得的信号相对于加入被测物的浓度作图，将此直线外推至横坐标，则可直接读出未知样品中被测物的浓度。紫外可见分光光度计的定量分析分光光度法被广泛的应用在各个领域，环境、医药、石油等测定无机、有机微量成份。由于操作简单，仪器廉价，一般说是常用的首选方法。（一）单组分的定量分析1、标准曲线（工作曲线）法：配制一系列不同浓度的标准溶液，在同一条件下分别测定吸光度，然后以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制A-C关系曲线。●符合朗-伯定律，则得到一条通过原点的直线。●根据测得样品吸光度，从标准曲线中求得样品溶液浓度，最后计算含量。原理:根据朗伯-比尔定律，选择合适λ测A，求出浓度。2、标准对照法以该物质吸收光谱图中

max为入射光，配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其AS，再将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度cX为：3、吸光系数法：根据朗-比定律，从已知的吸光系数K和液层厚度L，根据测得的吸光度值，求出溶液浓度和含量。此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。（二）多组分的定量分析法在含有多种组分的溶液中，如果要测定多个组分，可以根据情况的不同，采用不同的方法来进行测定。测量依据——吸光度的加和性：(1)(2)(3)(1)图计算法----两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

a图中，a,b组份最大吸收波长λmax不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。(2)图计算法---两组分吸收光谱部分重叠①a、b两组分的吸收光谱部分重叠，此时λ1处按单组分测定a组分浓度，b组分此处无干扰。②在λ2处测得混合溶液的总吸光度A2a+b,根据加和性计算cb，假设液层厚度为1cm,则：A2a+b=A2a+A2b=E2a·ca+E2b·cb(1)(3)图计算法----两组分吸收光谱完全重叠--混合样品测定

(3)图中，a,b吸收光谱双向重迭，互相干扰，在最大波长处互相吸收。处理方法如下：解线性方程组过程：（三）示差分光光度法（示差法）

普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则：

Ax=E·L·cxAs=E·L·csΔＡ＝Ａx－Ａs=E·b(cx－cs）=E·L·Δc测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液吸光度差ΔＡ。示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx=cs+Δc有机化合物的紫外—可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果：σ电子、π电子、n电子。COHnpsHsp

*s*RKE,Bnp

E分子轨道理论：成键轨道—反键轨道。Ultravioletspectrometryoforganiccompounds第六节、紫外吸收光谱在有机物结构分析中的应用吸收带1.R带从德文Radikal(基团)得名

为n→π*跃迁引起的吸收带。如羰基－CO－,－NO2、－CHO等，其特点为吸收强度弱，ε＜100，吸收峰波长范围250~600nm；2.K带从德文Konjugation(共轭作用)得名

为π→π*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，ε＞104，最大吸收峰位置一般在217～280nm。共轭双键增加，λmax向长波方向移动，εmax也随之增加；吸收光波长范围在200～500nm3.B带从德文Benzenoid(苯的)得名

为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引起的。苯蒸气在230～270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为苯的多重吸收带或精细结构吸收带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，ε＝220。

是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的跃迁所产生的。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm附近，ε=47000，E2在204nm，ε=7900，均为强吸收。4.E带

羰基双键与苯环共扼：K带强；苯的E2带与K带合并，红移；取代基使B带简化；氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱；CCH