生化分析实验课紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线

紫外分光光度法

测定蛋白质吸收光谱曲线一实验原理

蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。二实验目的与要求（1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。

（2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。

（3）、了解和掌握蛋白质的定性原理。三实验主要仪器与器材

3-1、实验仪器

（1）、紫外分光光度仪

（2）、混合器

（3）、天平3-2、实验器材（1）、定容瓶（2）、烧杯（3）、滴管（4）、骨勺（5）、称量纸（6）、剪刀（7）、镊子（8）、洗瓶（9）、玻棒（10）、记号笔（11）、标签纸（12）、坐标纸四试剂及配制4-1牛血清白蛋白

[试剂纯,上海试剂有限责任公司]

牛血清白蛋白溶液的配制（1.0毫克/毫升）：

称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度为1.0毫克/毫升的溶液。

五操作步骤与结果

5-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定

采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白标准品或测试样品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水（或溶剂）为空白溶液，调仪器零点（具体方法详见仪器操作说明书）。标准品或测试样品溶液在250—300nm波长的范围内，以每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值于表1

中（结果见表1）。在每次更换测定波长时均需要重新调节仪器零点后，方能测定。对测定波长的范围和间隔大小，可根据不同样品的实际情况和要求加以确定。牛血清白蛋白标准品溶液在不同波长测定结果

表1-牛血清白蛋白样品溶液在250—300nm波长吸光度结果表波长（nm）

250.0255.0260.0265.0270.0275.0277.5吸光度(A)

波长（nm）

280.0282.5285.0290.0295.0300.0305.0吸光度(A)

5-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作

以表1测定的波长为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标对应作图。然后分别将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中吸收峰所对应的波长即为蛋白质最大吸收波长，结果见图1。图1蛋白质的紫外吸收光谱曲线图

图1、牛血清白蛋白在250—300nm波长吸收光谱曲线图友情复叙（1）、需要强调的是：紫外、可见分光光度法测定样品时都需要用一个“空白管”，它主要是用于仪器校“零点”用。空白管一般又习惯称“零管”和“对照管”。（2）、能作为“零管”溶液的条件？一般要求是：被测定的溶质的溶剂作为零管溶液，但是如果实验本身要求不高或所用溶剂与蒸馏水在某一特定的波长吸光度差异很小（比较过），也可以直接用蒸馏水甚至自来水代替。（3）、在特征吸收峰附近波长间隔尽量要小，否则会错过真正的特征吸收峰值。特征吸收峰通常又称最大吸收峰，如蛋白质、核酸分别在280nm和260nm时的吸收值最大。（4）、在吸收光谱曲线及含量的测定中，要达到结果的准确性，除了自身的操作水平外，还要保证分光