神经生长因子诱导神经母细胞瘤分化的研究

神经生长因子诱导神经母细胞瘤分化的研究【摘要】目的观察神经生长因子对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞增殖的抑制和可能的分子机制及NGF-TrkA信号传导途径在NB细胞分化中的作用。方法取本院住院患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养作为细胞模型，通过台盼蓝拒染法计数活细胞；观察NGF干预前后细胞形态学变化；MTT法检测细胞的增值活性；RT-PCR分析TrkA表达情况。结果NGF作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并可剂量依赖性的抑制细胞增殖，2d时TrkA表达增加，4d以后出现TrkA表达的明显增加。结论NGF对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化，且表现剂量依赖关系；NGF可诱导NB细胞分化成熟及TrkAmRNA表达水平增高，可能是NGF诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一。

【关键词】神经母细胞瘤神经生长因子细胞分化

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferentiationandproliferationofneuroblastoma(NB)cellsinducedbynervegrowthfactor(NGF)anditspossiblemechanisms.MethodsNBtumortissueswerecollectedandprimarycellculturewasperformed.Trypanblueexclusionwasusedtocountthealivecells.Morphologicalchangeswereobservedunderthephase-contrastmicroscope.ThechangeofcellproliferationwasdeterminedbymeansofMTTassay.TrkAexpressionwasexaminedbyRT-PCRmethod.ResultsByday,thealivecellsofgroupA、BandCdecreasedbytreatmentofNGF;morphologicalchangesofNBcellswerealsoobserved.RT-PCRdetectionshowedthattheTrkAmRNAexpressionincreasedfromdayandreacheditspeakondayinatimeanddosedependentmannerbytreatmentofNGF.ConclusionNBcellstreatedbyNGFdifferentiatetoneuron-likecellsandthecellgrowthisinhibitedinadose-dependentmanner.TrkA'sexpressionisincreasedbyNGF.ThismaybeoneofthemechanismsofspontaneousregressionofNB.

【Keywords】neuroblastomanervegrowthfactorcelldifferentiation

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神经嵴细胞的儿童恶性肿瘤，自然退化常见于新生儿、婴儿和早期肿瘤，而较大儿童晚期患者恶性程度高，预后差。对化疗耐药是治疗失败的主要原因［1］。如何应用人为方法使NB细胞分化、逆转、消退，是当今肿瘤界研究的热点问题［2］，用药物诱导NB向良性转化可能成为临床治疗的一个新途径。

1资料与方法

一般资料

岁男性患儿，因发现“腹部肿物”1周，于XX年6月10日入住本院，行腹部B超、CT检查，考虑为神经源性肿瘤；于XX年6月12日行剖腹探查、腹部肿物切除术。手术标本冰冻切片提示神经母细胞瘤。为Evans分期Ⅲ期，无远处转移，术后病理诊断：神经母细胞瘤。

研究方法

(1)试剂：NGF购自晶美公司；MTT购自华美公司。其它均为国产分析纯试剂。Trizol购自美国GBICO公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；TaqDNA合成酶、琼脂粉购自上海生工生物工程公司；DNAMarker购自宝生物工程大连公司；引物TrkA引物序列根据Genebank资料设计如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，扩增产物为528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)内参照引物由北京赛百盛公司合成。(2)NB细胞培养：用消化法进行原代细胞培养，培养基为DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素/ml，在5%CO2、95%空气环境中恒温恒湿孵育。(3)实验分组：用作生长及分化研究的NB细胞分成4组。A组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为5μmol/L；B组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为10μmol/L；C组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为20μmol/L；D组：作为对照组，培养基中不加NGF干预。每组设4份同样的标本。(4)活细胞计数：取指数生长期细胞，接种至24孔培养板,细胞浓度为1×105细胞/ml，于0、2、4、6、8d用台盼蓝拒染法计数活细胞。(5)细胞形态学观察：用作分化研究的细胞，以1×103/ml密度接种至25ml培养瓶中，A、B、C、D组同时接种，于0、2、4、6、8d在相差显微镜下计数分化细胞。方法：对每瓶细胞选取5个不同视野的200个细胞，根据Sandquist法，有一个或一个以上的轴突长度延伸至胞体直径二倍以上者为细胞分化，计算细胞分化百分率。(6)MTT法检测NB细胞增殖活性原理：活细胞，特别是增殖的细胞中，其中线粒体能量代谢中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的四甲基偶氮唑盐(MTT)还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内和细胞周围，形成的结晶与细胞数成正比，用酸化异丙醇溶解结晶即可在酶标比色计上直接比色，此数值的升高标志细胞能量代谢旺盛、增殖活跃。检测方法：细胞培养于96孔培养板中，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养1h使细胞贴壁，按A、B、C、D组要求加入NGF，继续培养2h；吸去培养液，用PBS洗涤细胞一次；每孔加浓度5mg/ml的MTT染液20μl(溶于PBS中，滤过除菌，4℃避光保存)于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续孵育细胞4～h；加入新鲜配制的DMSO溶解MTT150μl/孔，水平摇床上摇10min，使还原产物充分溶解，酶标仪上570nm波长下测定光密度值。(7)TrkA表达检测：①NB细胞总RNA的提取：将培养的细胞用Trizol提取总RNA，紫外分光光度计测吸光度OD260值和OD280值，计算提取物浓度及纯度。经定量后用DEPC水稀释至1mg/ml，-20℃保存。②逆转录合成cDNA：根据逆转录试剂盒操作步骤合成cDNA。③PCR扩增反应体系：反应体系为25μl，PCR反应参数：94℃预变性5min，变性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环。④扩增产物半定量分析：取10μl扩增产物在含溴化乙锭(μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪观察RT-PCR扩增产物，与Marker比较鉴定结果，凝胶成像分析系统扫描扩增带，用TrkA/β-actin比值表示TrkA的相对表达水平。

统计学处理

用SPSS软件进行方差分析，两均数比较采用校正t检验。

2结果

.1NGF对NB细胞活细胞计数的影响见表1。表1不同作用时间的活细胞计数比较注：*Ｐ.2NGF诱导NB细胞分化观察

NB细胞呈小梭形，部分呈泪滴状，少数呈三角形。经NGF干预后，2d后开始出现形态分化，细胞变短、变圆，逐渐有神经突起形成，类似树突、轴突，整个细胞形态由原来的小梭形变为类多边形，类似成熟的神经节细胞。不同作用时间、不同浓度NGF干预的细胞分化百分率见表2。表2不同作用时间、不同浓度NGF对NB细胞分化百分率的影响注：*P.3NGF对NB细胞增殖的抑制见表3。MTT检测结果显示NGF剂量依赖性的抑制NB细胞的增殖。表3NGF抑制NB细胞增殖注：A、B、C三组与D组相比P.4不同浓度NGF对TrkAmRNA/βactin比值的影响见表4。NGF不同浓度诱导后，随着作用时间和浓度的增长，TrkAmRNA表达均增强，与作用时间和NGF浓度正相关。表4不同浓度NGF对TrkAmRNA/β-actin比值的影响

3讨论

NB是小儿最常见的实体瘤之一，起源于原始神经嵴［3］，恶性度极高，早期易发生肝和皮肤转移，50％以上发生骨髓转移，预后极差，但部分患者具有自行消退和体外诱导分化成熟的特点，有研究认为细胞周期G1期“限制点”的Rb通路蛋白表达参与了神经母细胞瘤向良性的转化［4］。探讨诱导瘤细胞分化成熟的因素具有至关重要的意义。

神经生长因子是最早发现的生长因子，β亚基是NGF的活性部分，称为β-NGF，也可称其为神经生长因子，它是一种较强的促细胞分裂因子，作用广泛，效应细胞多，在神经元的存活、生长、发育和分化及损伤修复与再生等方面具有重要的作用，有研究证实在神经母细胞瘤细胞中转入NGF基因，具有诱导其分化的作用［5］。本结果显示NGF本身对培养的瘤细胞也具有诱导分化、抑制增殖和刺激TrkA受体表达的功能。一般认为，NGF通过与受体结合而产生促进NB细胞分化的作用，主要通过高亲和力受体TrkA介导，缺乏TrkA受体或其结构异常是神经母细胞瘤产生和不分化的重要原因［6］。本研究中NGF时间和剂量依赖性的促进TrkAmRNA表达，并使分化细胞的百分比显著升高，证实其具有通过诱导TrkA高表达而引起NB细胞分化的功能。TrkA主要由一种跨膜酪氨酸激酶gp140trk组成，它是原癌基因Trk的产物。当NGF与TrkA结合后，通过RAS/MAPK信号通路的激活，影响基因的转录和翻译，表现为对细胞生长的调控［7］。本研究中NGF使活细胞数减少，剂量依赖性的抑制细胞增殖。NGF与TrkA间的相互作用是影响恶性肿瘤细胞生长和扩展、播散的重要因素，TrkA与其配体NGF结合引发信号传导的瀑布式级链反应。本研究证实NGF可在体外诱导NB瘤细胞向神经元方向分化，在NB患儿向成熟方向分化过程中起到重要作用。近年来的研究表明，TrkA所介导的信号传导通路在NGF诱导包括神经母细胞瘤在内的多种神经源性体外培养细胞分化过程中起到较为决定性的作用［8］

RAS/MAPK信号通路的激活，对于NGF介导的NB细胞的分化来说，可能是最重要的。与凋亡有关的基因c-myc与神经生长因子共同调节细胞凋亡，NGF能选择性诱导NB细胞向神经元方向分化的瘤细胞中c-myc表达下降，提示NGF可能还通过抑制c-myc表达而促进分化。从恶性肿瘤细胞向成熟分化逆转这个角度出发，本研究结果具有重要的意义，可作为对该肿瘤进行实验性基因治疗的重要指标。

【参考文献】

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