分子生物学第一章

第一章

核酸的分子结构、性质和功能核酸由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。最早由F.

Miescher于1868年在脓细胞中发现和分离出来。包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）除少数病毒（RNA病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有机体的遗传物质是DNA。核酸的组成成分核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase或嘧啶碱pyrimidinebase碱基base核糖→

RNA或脱氧核糖→DNA戊糖amylsugar1、戊糖：核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核酸的组成2、碱基(base)核酸中的嘧啶碱基核酸中的嘌呤碱基嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）3、核苷（戊糖+碱基）OHOH2COHHOH1′2′3′4′5′脱氧核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤脱氧腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷核苷核糖核苷（上）与脱氧核糖核苷（下）4、核苷酸（核苷+磷酸）OHOH2COHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤脱氧胸苷PO-O‖5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸O-—核苷酸核糖核苷酸（上）与脱氧核糖核苷酸（下）第一节DNA的结构和功能

一、DNA的一级结构☆概念：

是指四种脱氧核苷酸（dAMP、dCMP、dGMP、dTMP）通过3’,5’磷酸二酯键连接成具有一定长度的多聚体（脱氧核苷酸的数量），以及这些脱氧核苷酸的排列顺序。DNA一级结构的表达方式书写：线条式和文字式核苷酸之间的连接方式是：DNA中前一个脱氧核苷酸的3’羟基和下一个脱氧核苷酸的5’磷酸形成3’,5’磷酸二酯键。通常碱基顺序从DNA链的5′→3′方向书写。名称：DNA序列/DNA顺序、碱基序列HO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-A5′GTA3′DNA序列（一级结构）：

e.g.甲苯双加氧酶基因

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ctag生物学意义DNA一级结构决定了DNA分子的多样性由1000个脱氧核苷酸组成的DNA，有41000个排列组合，即有41000个DNA分子DNA一级结构的不同是物种间差异的根本原因。“基因”与“DNA”不同的基因，其DNA顺序不同二、DNA的二级结构☆概念：指两条脱氧核苷酸链（DNA单链/一级结构）以反向平行的形式，围绕一个中心轴盘绕所形成的双螺旋结构。DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(DNA单链)组成。两条链走向相反，沿着同一根轴平行盘绕，形成双螺旋结构。碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。螺旋内部：A-T,G-CDNA的双螺旋结构特征大沟小沟DNA二级结构模式右手螺旋B型：最稳定的构型，生理条件下，DNA双螺旋大多以B型形式存在。

A型C型、D型左手螺旋Z型不同构型的DNAWatsonandCrick双螺旋结构模型DNA双螺旋结构（B型DNA）1979年Rich等在研究人工合成的CGCGCG的晶体结构时发现。结构特点是两条反向平行的多核苷酸互补链组成的螺旋呈锯齿形，其表面只有一条深沟，每旋转一周是12个碱基对。其功能可能与基因表达的调控有关。

Z-DNA B-DNA

Z型DNA生物学意义DNA二级结构的各种构象间、二级结构和高级结构间、以及高级结构间的各种构象变化，始终处于一个动力学平衡中，是基因表达调控的基础三、DNA的三级结构概念：指在DNA双螺旋结构基础上，进一步扭曲折叠所形成的特定空间结构。超螺旋DNA：指DNA双螺旋通过弯曲和扭转所形成的特定构象，是DNA三级结构的一种结构模式。正超螺旋：使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加负超螺旋：可以减少双螺旋的圈数。几乎所有天然DNA中都存在负超螺旋结构。DNA的超螺旋结构闭合环状DNA形成的超螺旋共价闭合环状DNA分子生物学意义DNA的超螺旋化及其程度，在整个DNA分子中并不是均匀的，而DNA特定区域中超螺旋程度的增加和改变，有助于DNA的构象转化，从而促使DNA双链解链或局部熔解，这种结构上的变化对复制、转录等的启动具有重要的调控作用1957年发现在基因的调控区或染色质的重组部位有DNA的三螺旋结构四、三链DNAHoogsteen配对在三股螺旋中，通常是一条同型寡聚核苷酸与寡聚嘧啶核苷酸-寡聚嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合。第三股的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对。第三股螺旋与寡聚嘌呤核苷酸同向平行。类型：Py.Pu*Py

Py.Pu*PuDNA→→→染色体

DNA的高级结构第二节RNA的结构和功能RNA的结构单链线型局部双螺旋结构、环状结构高级结构功能mRNA，tRNA，rRNA其他小分子RNARNA的功能mRNA(messengerRNA，信使RNA）是蛋白质合成的模板tRNA（transferRNA，转运RNA）转运活化的氨基酸至mRNA模板上rRNA（ribosomalRNA，核糖体RNA）为核糖体的主要部份，功能为提供一个环境能使tRNA对应到mRNA上的密码子，而合成蛋白质。核苷酸语言—氨基酸语言一、mRNA，tRNA，rRNA（一）mRNA和hnRNA核内不均一RNA(hnRNA)

真核生物中，细胞核基因转录初产物RNA的平均长度比mRNA长，性质非常不稳定，序列的复杂程度也非常高，因此称之为核内不均一RNA(hnRNA)，主要为mRNA前体。mRNA是蛋白质合成的模板真核生物mRNA的结构特点①3’-端具有polyA结构②mRNA的5’端有一个“帽子”结构：

m7G5’pppN防止核酸外切酶对mRNA的降解识别起始点（核糖体识别mRNA）③只有一个开放阅读框（ORF），只能编码一条肽链

开放阅读框开放阅读框(openreadingframe,ORF)

从mRNA分子上5

端起始密码子AUG到3

端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链真核生物和原核生物mRNA结构比较真核生物mRNA原核生物mRNA70-90个核苷酸组成3′端：CCA序列（CpCpAOH

）氨基酸通过与3′-OH端连接，形成氨基酰-tRNA分子含稀有碱基如假尿嘧啶核苷(ψ)，各种甲基化的嘌呤和嘧啶核苷，二氢尿嘧啶等

tRNA一级结构特点（二）tRNA的结构与功能三叶草结构氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码环额外环TψC环tRNA二级结构特点密码子-反密码子反向互补配对tRNA三维结构

tRNA与酶结合的模型tRNA氨基酰-tRNA合成酶ATP氨基酸+

tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶蛋白质生物合成的起始：氨基酸的活化（即形成氨基酰-tRNA）氨基酰-tRNA（三）rRNA16SrRNA结构特征：茎环结构rRNA为核糖体主要成分rRNA为核糖体的主要部份，其功能为提供一个环境能使tRNA对应到mRNA上的密码子，而合成蛋白质。mRNA核糖体肽链粗面内质网核糖体是蛋白质的生物合成的场所核糖体是最小的细胞器，光镜下见不到的结构。在1953年由Ribinson和Broun用电镜观察植物细胞时发现胞质中存在一种颗粒物质。核糖体的结构组成核糖体种类亚基rRNA蛋白质分子数目原核生物70s（30s、50s）16s5s23s2134真核生物80s（40s、60s）18s5s5.8s28s3050二、其它小分子RNA真核细胞的小分子RNA：核小RNA（snRNA）：核内

胞浆小RNA（scRNA）：胞浆内端粒酶RNA和核酶端粒酶（telomerase）是一种自身携带RNA模板的的逆转录酶，催化端粒DNA的合成，能够在缺少DNA模板的情况下延伸端粒内3′端的寡聚核苷酸片段。核酶（ribozyme）是具有酶作用的一类RNA第三节核酸的分子杂交一、核酸分子杂交的基本原理在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链——变性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程复性核酸的杂交两条来源不同，但具有互补序列的核酸（DNA或RNA），按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交（hybridization）

，或称分子杂交。DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：核酸探针（nucleicacidprobe）

指能与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。通常是人工合成的。二、核酸探针及标记

探针的标记探针以共价键形式结合能够产生强烈信号的基团、原子、或能与一些产生强烈信号分子特异性结合的配体。标记物：同位素、荧光基团、发光基团、生物素等三、核酸分子杂交的应用（一）SouthernBlot用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断SouthernBlot方法：将DNA经限制性内切酶酶切后进行琼脂糖电泳把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜（硝酸纤维素膜）。利用标记的探针与固着于硝酸纤维素膜上的DNA发生同源性杂交利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。

SouthernBlot实验流程分子杂交技术的应用SouthernblotNorthernblotWesternblot原位杂交基因芯片检测DNA片段检测RNA片段蛋白质印迹组织或细胞水平原位杂交复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上（五）生物芯片——基因芯片生物芯片（biochip）将数以万计的生物大分子探针分别固定在一个微小载体的表面制成的芯片。基因芯片基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，简单地说就是在一块指甲大小（1cm3）的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理）布放数千或数万个核酸探针。1、将大量寡核苷酸分子固定于支持物上基因芯片基本原理2、然后与标记的样品进行杂交

3、通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统

SouthernBlot和NorthernBlot技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。应用价值：基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及基因测序等。第四节反义核酸及药物1978年，Stephenson和Zarmmeenik首次报道了反义寡核苷酸（antisense

oligodeoxyribonucleotides，AS-ODN）可抑制劳斯肉瘤病毒（RSV）的复制。1984年，Lzant和Weintraub又提出了“反义核酸技术”的概念，即根据碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭基因表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。反义核酸的概念反义核酸根据碱基互补原理，人工合成或生命体合成的特定的DNA或RNA片段，与目的核酸序列互补结合，通过空间位阻效应或诱导RNase活性的降解作用，抑制或封闭目的基因的表达。反义核酸的靶核酸区域mRNA5′端非翻译区mRNA5′端编码区mRNA5′端帽子形成位点区域mRNA3′端polyA形成位点区域阻止mRNA的成熟及向胞浆中的转运反义技术与药物反义DNA是人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。反义RNA序列与靶RNA（多为mRNA）的序列互补的RNA片段，通过与靶RNA形成双链复合物而影响其正常的修饰、翻译等过程，从而抑制或封闭靶RNA的功能。反义RNA作用机制反义RNA与基因治疗siRNA与基因治疗肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）是一种全新的DNA类似物。该分子的特点是以中性的类氨基多肽链取代了DNA中的戊糖磷酸骨架，其余的与DNA相同。

PNA可以通过碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。反义核酸在疾病治疗中的应用

用于肿瘤治疗用于病毒感染的治疗用于血管性疾病的治疗用于遗传性疾病的治疗第五节RNAiRNAi(RNAinterference)即RNA干扰，是近年来发现的在生物体内普遍存在