分子生物学第五章-DNA分子基本操作技术课件

第五章DNA分子基本操作技术122013年诺贝尔生理学或医学奖北京时间10月7日下午5点30分，美国、德国三位科学家詹姆斯-E.罗斯曼、兰迪-W.谢克曼及托马斯-C.苏德霍夫因在细胞内运输系统领域的新发现而获得今年诺贝尔生理学或医学奖。诺奖委员会说，三人发现了细胞囊泡交通的运行与调节机制。3膜融合的发现表明蛋白质和其他物质可以在细胞内和细胞间进行传递，细胞可以用这一过程来阻止它们的活动并且避免混乱。这一突破性发现解释了为什么胰岛素释入血液时会有变化、神经细胞之间的信息传达，以及病毒感染细胞的方式。

4生物体内细胞的正常运转有赖于让合适的分子在合适的时间抵达合适的位置。一部分分子，如胰岛素，需要被转运出细胞之外，而其他分子则需要被在细胞内部进行运输。细胞内部产生的分子被包裹于囊泡之中（图中蓝色表示），但是这些囊泡具体是如何达成这种精准的运输的？这一点一直没有被理解。5RandyW.Schekman发现基因控制下的蛋白质在这种囊泡运输机制中起到重要作用。正如这里的图上所展示的那样，通过对比正常酵母菌细胞（左）和转运机制缺陷的细胞（右），他成功识别出操控这一转运过程的基因。6JamesE.Rothman发现一种蛋白质化合物（图中橘色表示）可以让囊泡实现与目标细胞膜的融合。囊泡上的蛋白质物质会与目标细胞膜上的特定蛋白质之间发生结合，从而让囊泡可以在正确的位置上释放其所运载的特殊“分子货物”。7ThomasC.Südhof研究了大脑中神经细胞之间是如何互相传递信号的，以及钙离子在这一过程中所起的作用。他识别出一种分子机制（图中用紫色表示），其可以对进入的钙离子发生反应并触发囊泡融合，从而解释了囊泡输运机制中时间的精确性是如何达成的，以及其所携带的信号分子物质是如何能做到受控释放。8约翰.戈登山中伸弥获奖理由：发现成熟细胞可被重编程变为多能性92012年诺贝尔生理学或医学奖第五章

DNA分子基本操作技术10

从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。11本章内容第一节核酸凝胶电泳技术第二节核酸分子杂交第三节PCR第四节转化第五节基因组文库构建第六节RNA操作技术第七节基因克隆12一、常规电泳

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、脉冲凝胶电泳第一节核酸凝胶电泳技术13一、常规电泳自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。14在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔1516171、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等181）凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围19凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。2）电泳缓冲液常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解2010×TBE缓冲液的配制配方Tris108克EDTA9.3克硼酸55克H2O至1000mlpH应为8.0～8.2临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释）213）核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb22核酸电泳的指示剂二甲苯青：水溶液呈兰色电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb234）载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置③使样品呈色，使加样操作更方便24溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。255）核酸电泳的染色剂在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光26琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间27称样溶解加热制板倒胶6）核酸电泳操作基本程序28取样点样电泳检测核酸电泳操作基本程序29结果30根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小31Agarosegelelectrophoresis322、聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离33聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间34聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N‘一四甲基乙二胺）和过硫酸铵（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的351）不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围

丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp）溴酚兰*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～1001245362）材料电泳仪器：电泳仪垂直电泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N‘一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml

装于棕色瓶内，4℃可保存二个月372）材料10%过硫酸铵过硫酰铵，1克，加水至10ml

4℃可保存一周，-20℃可保存一个月1×TBE电泳缓冲液TEMED（四甲基乙烯基二胺）383）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角按表配制所需%浓度凝胶的毫升数加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止39立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1×TBE缓冲液40小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡41接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗，紫外仪下观察结果聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）4243电泳结果分析DNAMarker

λDNA人工片段100bpladder44酶切分析根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究4546PCR-RFLP46二、脉冲凝胶电泳(PFGE)普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。超过一定大小的线状DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（50Kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，在常规电泳凝胶中彼此挤压，形成单一DNA迁移带。1984年Schwartz和Cantor首次利用脉冲凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PEGE）解决了这一问题。4748PFGE工作的基本原理PFGE工作的基本原理

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小，小分子DNA比大分子DNA更容易在凝胶中重新定位，因而迁移速度更快。该法可分离长至10Mb的DNA分子。B+A-+A-B49A-+AB-+B正交交变电泳凝胶电泳(OFAGE)电场逆转凝胶电泳(FIGE)夹角等值均一电场(CHEF)旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+PEGE类型50影响PFGE分辨率的因素1、脉冲时间（0.1s-1000s）：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2、电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。3、电场夹角：电场方向的夹角常为110O-120O，研究证实90O夹角也非常有效。4、温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。51第二节核酸分子杂交

核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

52核酸的分子杂交将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。53不同温度下DNA的构型变化一54不同温度下DNA的构型变化二55

杂种核酸分子：

彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。

DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系

DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。56一、核酸杂交常用几种膜的性能比较571、硝酸纤维素膜

不能滞留小于150bp的DNA片段，不能同RNA结合。

改进：应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。

RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。58

尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：

1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用

2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。592、Southern（萨瑟恩）DNA印迹杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。60Southern印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳 转移杂交，显影酶切DNA样品上样 DNA印迹重物缓冲液61杂交模式图放射自显影DNA印迹转移探针杂交－＋62Southern杂交(Southernbloting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测6364（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术656667SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。68SouthernBlotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.结果检测69在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术，虽然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。常用的荧光染料：C5、C3等703、诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。71

1、Northernblot基本原理和基本过程与Southernblot基本相同

2、用于鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNA72Northern印迹与Southern印迹的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern

印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNA73Westernblotting（韦斯顿蛋白质杂交技术）将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopment744、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交

斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种类似的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应于核酸样品的定量检测。75

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量76斑点印迹杂交将RNA或DNA直接点样于NC膜或尼龙膜上，可做半定量分析优点：简单、快速、可同时检测多个样品一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。DNA斑点杂交RNA斑点杂交完整细胞斑点杂交7778（1）DNA斑点杂交：①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μgDNA)。④将膜烘干，密封保存备用。（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/

氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μlDEPC水，加5μl

甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然

后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。794、菌落杂交

也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。鉴定重组子。80检测重组体克隆的菌落杂交技术81821）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交83

保持组织细胞的形态对核酸无抽提、修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定2）杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：84（2）组织细胞杂交前的预处理

去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落85（3）探针的选择与标记

以获得最好杂交效果为依据选择探针探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb

放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察86（4）杂交

杂交液体积小：10~20μlcDNA和RNA探针杂交温度约为50℃

杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性冲洗温度一般不超过50℃87（5）杂交结果检测

所用探针为核素标记,放射自显影检测所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测8889直接法荧光原位杂交原理89荧光原位杂交

（fluorescentinsituhybridization，FISH）905、蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术911）凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）

又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay），也称作ElectrophoreticMobilityShiftAssay（EMSA），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理：

DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。92凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合93不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片段结合的蛋白质分子而且可以研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）94(a)(b)(c)

在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用（a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。**********蛋白质与未标记的竞争DNA结合凝胶电泳放射自显影蛋白质与标记的探针DNA结合**********95

可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。

1.用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子

2.在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。96

凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而DNaseⅠ足迹实验可以解决这个问题972）DNaseⅠ足迹实验（footprintingassay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。9832p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)(b)DNaseI足迹实验99

如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。100硫酸二甲酯（DMS）足迹实验：

DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。

而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。101甲基化干扰实验（methyltioninterferenceassay）根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。102GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化与蛋白质提取物混合与蛋白质结合不与蛋白质结合与蛋白质结合凝胶电泳与蛋白质结合的DNA带含有Ⅰ和Ⅲ两种类型DNA片段不能与蛋白质结合的DNA带含有全部三种类型DNA片段切除所有结合与不结合蛋白质的DNA带，并用六氢吡啶切割甲基化的G残基结合带非结合带缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义，它得到结合蛋白质的保护甲基化干扰实验1034、体内足迹实验GG×GG×meGGGGMeMe完整的细胞裸露的DNADMS硫酸二甲酯分离DNA并用六氢吡啶切割凝胶分析PCR扩增受保护的G残基应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验104105基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray106转录组学的研究方法－DNA芯片技术107基因芯片技术流程一、PCR技术原理二、PCR技术主要类型三、PCR技术主要应用第三节聚合酶链式反应108PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。一、PCR技术原理109（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长110PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物111PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶112PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……113PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖114

PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K.Mullis），他获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在许多作品中，包括1990年在《科学美国人》上的一篇文章，及1998年的自传《心灵裸舞》（DancingNakedintheMindField），都曾提到PCR这个构想的起源。115“顿悟”

那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。116PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想

逶迤崎岖的山路行驶的汽车

1988年发明了PCR技术

1993年获诺贝尔奖117118KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。119国内复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC51A/B型DNA热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。120PCR发明不到10年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章发表。1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCrMethodsandApplication）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。1211993年度诺贝尔化学将已于10月13日揭晓，KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”一名加拿大籍英国科学家MichaelSmith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣。122引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段123Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402012472℃94℃55℃PCR循环125（二）PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先将待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。126127PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；128PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；129PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。130Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。131TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon132（三）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应条件：10X缓冲液10μL4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/L133PCR仪134PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点1351234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍136模板DNA95℃137PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物138PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶139PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始140PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq141PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束142PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

143PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA144标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物(上、下游引物)10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双蒸水至100ul（四）PCR反应体系1451、PCR反应五要素（反应成分）引物（primers）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+

（magnesium）1461）引物理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增147引物设计的原则①引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列148引物设计的原则④避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处引物设计的原则⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：每条引物的浓度0.2~1umol，以最低引物量产生所需结果为佳引物浓度偏高会导致错配和非特异性扩增，且又增加引物之间形成二聚体的机会150GenBank网址：

使用Blast程序，输入引物序列，等待结果报告151引物设计网址/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi152DNAstarPrimerpremierSoftwareforprimerdesign依靠经验直接设计1532）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少1543）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等

浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。1554）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。1565）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1572、循环参数变性使双链DNA解链为单链

95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。

增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。158（3）延伸

70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加159PCR产物的积累规律在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。

多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。160

PCR产物的积累规律示意图161（五）PCR引物的设计一般原则①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。③G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。162④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。163（六）PCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分164二、PCR技术主要类型165PCR技术的主要类型1、反向PCR

6、锚定PCR2、不对称PCR7、原位PCR3、RT-PCR

8、重组PCR4、差异显示PCR

9、免疫PCR5、实时定量PCR

10、多重PCR1661、反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列167已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶1682、不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究169

高浓度引物低浓度引物1703、RT－PCR

反转PCR（RT-PCR）是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性，克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。171逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增172基因mRNA蛋白质多肽链173M01240124

C57DBAOPNβ-actin

1：0g/Kg乙醇

2：1g/Kg乙醇

3：2g/Kg乙醇

4：4g/Kg乙醇有文献报道，在乙醇作用下骨桥蛋白表达上调可能是对肝的一种保护。C57BL/6和DBA/2两种小鼠OPN的mRNA本地表达水平相当，在乙醇作用下，C57BL/6小鼠OPN的mRNA表达明显上调，DBA/2小鼠OPN的mRNA表达没有明显变化，这可能和C57BL/6J比DBA/2耐受乙醇有关。1744、多重PCR（MultiplexPCR）多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物1755、实时定量PCR技术原理实时定量PCR（也称TaqManPCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。176实时定量PCR(real-timePCR):通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。177实时荧光定量PCR:实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量PCR。178实时定量PCR具体实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。179实时定量PCR一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。实时荧光定量PCR技术中的一些重要因素：Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。

180实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。181TaqMan荧光探针SYBR荧光染料182TaqMan荧光探针原理和方法

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。183184

实时PCR技术原理185实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结束后,通过电脑分析,可直接给出定量结果。如果用其他PCR仪,则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号,计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率,RQ-代表空白管中二者的比率,△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。186由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。187

特点

FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。188实时荧光定量PCR应用（1）

病原体测定由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。189以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于TaqMan系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电泳及EB染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。190（2)肿瘤研究

意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。191(

3)基因表达研究

由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqManEZRT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高，而ET病人的TPOmRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO的作用提供了依据。192(

4)免疫组份分析

对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。193

(5)基因突变及多态性的研究

美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。194

(6)其他方面

日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷