脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识

脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adiposetissue-derivedstromal/stemcells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。1脂肪组织采集1.1脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。采集机构应具有完整的标准化操作规程(standardoperationprocedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。1.2脂肪组织供者要求对供者健康状况进行全面检查(如一般信息、既往病史和家族性遗传病等)及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)阴性、梅毒螺旋体阴性(提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml外周血用于复检，ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询)。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。若供者HIV、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度怀疑HIV感染或者考虑HIV感染窗口期的供者不予采集。1.3采集方式、采集部位和采集量1.3.1采集方式用肿胀液(生理盐水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋肾上腺素0.25mg)局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml注射器配备口径1.5~3.5mm、侧孔3.0~5.0mm的吸脂针，进入供区，形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3脂肪组织颗粒，若脂肪组织颗粒较大，则需要进行手工剪制。1.3.2采集部位选择下腹部或者大腿内、外侧或者身体其他部位(供者要求的吸脂部位)。接受注射溶脂、冷冻溶脂、热立塑及超声溶脂的部位不建议作为脂肪组织采集部位。供区针眼或切口处按压排除肿胀液，进行适当的加压包扎，24~48h后更换包扎敷料，预防感染，7d针眼或切口愈合。1.3.3采集量(脂肪组织，肿胀液除外)女性≤45岁，男性≤50岁，脂肪组织采集量不少于50ml。女性45~55岁、男性50~60岁者不少于80ml。男性体脂＞25%、腰围＞100cm，女性体脂＞33%、腰围＞88cm，不少于100ml。体脂率=[1.2×BMI+0.23×年龄－5.4－10.8×性别系数(男=1，女=0)]。女性＞55岁，男性＞60岁，或者近期服用减肥药者不建议采集脂肪组织提取ASCs。1.4脂肪组织运输和接收吸取的脂肪组织应保存于标准配置的无菌容器内，贴条码标签，应遵从安全与准确的原则，做到样本与供者一一对应，记录启运时间和到达时间，低温冷链运输，建议时间控制在48h内，送达制备机构。制备机构应设置脂肪组织的接收取样工作区，执行登记、初检、核对、暂存、交接等；目检脂肪组织有无污染或变质，应建立脂肪组织异常情况处置标准操作规程。2ASCs的制备与储存制备机构或研究应用机构应建立相应完善的SOP，所有试剂和原材料应明确其来源、批号、质量检定合格报告，应尽可能采用GMP临床应用级别的原料或国家已批准的可临床应用的产品，相关制备、生产记录及留样应至少保存至使用结束后3个月。制备人员应该经过专门的技术培训，ASCs的制备建议在B级背景下A级洁净度级别的环境中进行。2.1脂肪干细胞的分离采集的脂肪组织用无菌生理盐水冲洗，按照脂肪组织体积加入相应浓度Ⅰ型胶原酶(建议GMP级)或胰蛋白酶混合液，37℃水浴或气浴振荡，离心，吸弃上层脂肪和液体层，加入生理盐水重悬细胞沉淀，用细胞滤器过滤，去除未消化完全的组织团块，滤液离心，弃上清，获得基质血管成分(stromalvascularfraction，SVF)。SVF是围绕在脂肪细胞周围，含有内皮细胞、非特征性基质细胞、血液细胞、巨噬细胞、造血祖细胞、脂肪来源的基质/干细胞等细胞的异质性细胞群，台盼蓝染色进行细胞计数。填写细胞操作记录，包括组织酶解分离时间、细胞数量和活性等。2.2脂肪干细胞的培养与传代接种SVF至培养瓶中，培养条件为5%CO2、37℃常规培养，保持湿度。细胞融合度达到70%~80%时可以传代，收集消化的细胞悬液，接种至培养瓶中，传代培养，培养基应使用无血清培养基或不含血清添加物的细胞培养基。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量等。2.3建立脂肪干细胞种子细胞库收集P2或P3代细胞，做质量检测和性能指标检测(包括细菌、支原体、内外源病毒、细胞活力、细胞鉴别、生长特性、细胞纯度、均一性及内毒素等)，调整细胞浓度至(2~3)×106个/ml，分装至细胞冻存管中，贴标签，标注细胞数量、冻存日期及代次等。将冻存管程序降温后，转入–196℃液氮保存，即为种子细胞库，供建立工作细胞库用。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。2.4建立脂肪干细胞工作细胞库经脂肪干细胞种子细胞库传代增殖，将传至P5代的细胞制成均质细胞悬液，取样进行临床使用前的质量控制和安全鉴定。分装于一定数量的冻存管，贴好对应批次细胞标签，保存于–196℃液氮中，即为工作细胞库。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。工作细胞库的质量控制和安全鉴定＞种子细胞库质量控制和安全鉴定。2.5脂肪干细胞冻存数量脂肪干细胞冻存的数量是根据实际需求来计算的，应考虑后续检定需要、保藏年限、检测用数量及复检频率等，根据个体的需要确定，遵循“够用原则”。ASCs细胞制剂建议设1×107个ASCs为1个单位。填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。3ASCs的运输3.1参照中国医药生物技术协会《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，ASCs制剂采取冷链运输，建议运输时间控制在48h内。3.2应建立ASCs制剂运输的标准操作规程，运输方式等应经过验证。防止发生损害、变质、污染或其他不良影响。每批次ASCs制剂的整个运输过程应有发运记录，并能够追踪。3.3若存在安全隐患，应立即召回ASCs制剂，由制备机构进行合法和符合伦理要求的处置并记录存档。3.4制备机构如委托第三方机构运输ASCs制剂，应评估其承运机构的资质。承运人应接受制备机构相应的培训，确保其可按照脂肪干细胞制剂运输要求完成运输过程。应由设有资质的第三方机构复核ASCs制剂运输。4ASCs的质量安全性制备机构根据ASCs自身特性、临床研究情况，配备相关专业技术人员和设备，确立制剂质量检验操作规程，所有检测方法应经过验证，可以委托有资质的第三方开展相关质量检测。检验应满足安全性、质量可控性和(或)有效性的基本要求，检测结果应有质量负责人或质量受权人签字审核。4.1基本性能ASCs的基本性能指标包括细胞形态、周期倍增时间、细胞活性、增殖、细胞表型、集落形成、端粒酶活性等。4.2安全性能ASCs的安全性能指标包括微生物、内毒素、核型、致瘤性、毒性、残留物及人畜共患猪细小病毒检测，必要时包括病毒核酸检测，确保ASCs制剂临床应用的安全性。如果Asc采用胰蛋白酶消化,建议检测猪细小病毒。5ASCs的分化功能测定5.1向成骨细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成骨诱导液进行培养，第19天行茜素红染色，镜下观察。脂肪干细胞被茜素红染成红色，染色面积占总面积的比例≥50%。5.2向成软骨细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成软骨诱导液进行培养，第14天行甲苯胺蓝或Ⅱ型胶原蛋白抗体进行染色分析，染色面积占总面积比例≥80%。5.3向成脂肪细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成脂肪分化条件培养基，第12天行油红O染色，脂肪干细胞被油红O染成红色，染色面积占总面积的比例≥50%。6ASCs的组织再生功能检测6.1促血管形成功能用含100ml/LFBS的DMEM/F12培养体系将ASCs以1×105个/ml密度与脐静脉内皮细_胞共培养，4h后，镜下统计形成的血管环数≥37/10000个细胞。6.2巨噬细胞极化用含100ml/LFBS的DMEM/F12培养体系将ASCs以1×105个/ml密度与巨噬细胞共培养，24h后，与巨噬细胞对照组相比，用ELISA试剂盒检测上清中TNF-α、IL-1β、TGF-β及IL-10的表达水平，其中TNF-α、IL-1β水平应下降，TGF-β、IL-10水平应上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。6.3抗凋亡功能ASCs培养24h后，取上清液，培养成纤维细胞，与普通培养基成纤维细胞对照组相比，ASCs上清液培养的成纤维细胞组，成纤维细胞凋亡比例下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。此三项内容建议为ASCs质量的参考指标，应为制备机构或研究应用机构ASCs研究内容。7追溯7.1应建立完整的ASCs制备记录系统、标识标签系统、ASCs细胞制剂编码系统，以便于辨识并防止制剂混杂。7.2ASCs制备记录包括每天的细胞状况、细胞数量、培养条件等具体信息。标识系统应记录供者信息、脂肪组织收获日期及ASCs制备时间、细胞数量/体积、储存条件等。7.3每份ASCs细胞制剂应编制唯一的编码。编码应能追溯到供者信息以及该细胞制剂操作和最终处理的所有记录。7.4转移和运输记录应能追溯ASCs由采集机构到制备储存机构的所有流转过程。参与制订专家共识人员：汤苏阳：中国医药生物技术协会皮肤软组织修复重建技术分会主任委员，原武警总医院皮肤再生医学科主任史央：江苏得康生物科技有限公司技术总监郑岩：成都华美紫馨医学美容医院主任于卉影：原沈阳军区总医院生物医学实验室主任邵小燕：上海赛傲生物技术有限公司技术总监，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会细胞制备与存储学组组长陈惠华：北京恒峰铭成生物科技有限公司技术总监共识评审专家：夏照帆：中国工程院院士，海军军医大学全军烧伤研究所所长艾玉峰：美莱集团总医院院长，中国医师协会美容与整形医师分会副会长，中国整形美容协会美容与再生医学分会副会长，中国整形美容协会民营医疗机构分会副会长，PAAFRRS中国整形分会副主席杨力：四川华美紫馨医学美容医院院长，中华医学会整形外科分会肿瘤整形外科学组副组长，中华医学会整形外科分会血管瘤与脉管畸形学组副组长郜恒骏：中国医药生物技术协会生物样本库分会主任委员，上海分子医学工程技术研究中心主任，上海生物芯片国家工程研究中心副主任蔡志刚：北京大学口腔医院副院长，中华医学会组织再生专业委员会常委马洁：北京医院生物治疗中心主任魏英杰：中国医学科学院北京协和医学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室教授(PI)王建华：首都儿科研究所生物技术研究室教授(PI)张传宇：中国研究型医院学会细胞研究与治疗专业委员会副主任委员郝好杰：中国香港生命工程研究院首席教授侯明晓：原沈阳军区总医院院长，全军医学科学技术委员会重症医学委员会副主任委员胡敏捷：苏州般若生物科技有限公司总经理姜笃银：山东大学第二附属医院烧伤整形科主任史春梦：陆军医科大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室副主任，复合伤分室主任卢安军：银河生物江苏得康公司