分解纤维素的微生物的分离

分解纤维素的微生物的分离㈠纤维素与纤维素酶1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。一、基础知识

植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。

在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。

人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失

讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？提示：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？刚果红染色法

刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（二）纤维素分解菌的筛选

当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实验设计

请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。土壤取样选择培养梯度稀释

将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上

筛选产生透明圈的菌落①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中操作步骤

生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

①目的：②制备选择培养基：③操作：

将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用

说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养酚酞遇氨显红色刚果红显色法思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？

本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释1011021031041051064.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基:（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：先

，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在

时就加入刚果红。培养微生物倒平板5.刚果红染色法

挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。这两种方法各有哪些优点与不足？染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。从而形成假阳性反应比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法刚果红染色法方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！

在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。6、纯化培养四、结果分析与评价

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________实验，纤维素酶的发酵方法有______发酵和______发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________含量进行定量测定。发酵产纤维素酶

液体

固体

葡萄糖

五、课题延伸分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结高考真题(2011新课标全国I卷)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：⑴在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以

为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于

培养基。⑵纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即

和

。

⑶为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围透明圈的大小，透明圈大说明该菌株的降解能力

。⑷通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、

和

。无菌技术要求试验操作应在酒精灯

附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。原油

选择平板划线法

稀释涂布平板法强干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰(2016新课标全国I卷)[生物——选修1：生物技术实践]（15分）

空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题:

（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

牛肉膏、蛋白胨琼脂

①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题:

（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_____________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。

将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间污染不正确牛肉膏、蛋白胨琼脂（2015新课标卷Ⅰ，39，15分）39.[生物——选修1：生物技术实践已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用于

染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用

（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以

为唯一碳源的固体培养基进行培养。（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用

直接计数；若要测定其活菌数量，可选用

法进行计数。（4）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，

℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕

℃设计后续实验。

苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）萃取法油脂血细胞计数板稀释涂布平板4540（2014课标Ⅰ卷）39.[生物——选修1：生物技术实验]（15分）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题:（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将

分解成

。（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成

色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的

。

纤维二糖

葡萄糖红

透明圈（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：注：“+”表示有，“－”表示无。据表判断，培养基甲

（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是

；培养基乙

（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是

；酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲++++-++培养基乙+++-+++不能液体培养基不能用于分离单菌落不能乙培养基中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌(2016四川卷)10.（12分）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列（1）图中选择培养基应以

为唯一氮源；鉴别培养基还需添加

作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成

色。（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105

的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是

，每克土壤样品中的细菌数量为

×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较

。

尿素酚红红稀释涂布平板法1.75少（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为

，突变基因表达的蛋白质含

个氨基酸。UGA115(2016全国卷III)39．某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用_________________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是_________________。（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_________________和_________________。分离纯化时应挑选出_________________的菌落作为候选菌。（3）乳酸菌在-20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_________________（填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”）。无菌水在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的乳酸菌将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸

鉴别能产生乳酸的乳酸菌产生透明圈甘油（2014课标Ⅱ卷）39．[生物——选修1：生物技术实践]（15分）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题：（1）该小组采用

法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是

；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为

。（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过酒精灯火焰进行

灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是

。（3）示意图A和B中，

表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的

的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高

的利用率。稀释涂布平板检测培养基平板灭菌是否合格3.8×107灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落B

溶解氧营养物质

（2014四川卷）10.有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。（1）微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是__________。（2）与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基常需添加生长素和_______，这些植物激素一般需要事先单独配置成_________保存备用。（3）纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其它划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有可能是________。（4）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是________，该实验设计是否合理？为什么？_______。

氮源和无机盐只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖细胞分裂素母液接种环接种环灼烧后未冷却目的菌株能分泌降解苯磺隆的酶

不合理，缺少空白对照（江苏卷）30.（8分）为了获得β-胡萝卜素产品，某小组开展了产β-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：（1）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是

；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该

。（2）为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是

。（3）右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是

。（填序号）①安全阀、放气阀、压力表②放气阀、安全阀、压力表③安全阀、放气阀、温度表④放气阀、安全阀、温度表（4）为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是

。（5）为增加β-胡萝卜素提取量，在研磨酵母细胞时，添加石英砂的目的是；研磨时（填“需要”或“不需要”）添加CaCO3，理由是

。 干热灭菌和高压蒸汽灭菌用报纸包扎器皿抑制细菌（放线菌）生长

①接种环温度过高，菌种被杀死不需要

β-胡萝卜素较耐酸（2013新课标II卷）39.[生物——选修1：生物技术实践]（15分）临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用

法或

法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。（2）取该单菌落适当稀释，用

法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀至于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A

；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B

；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明

；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的

。（4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素

。平板划线稀释涂布平板涂布敏感不敏