JJF(鲁) 138-2022 荧光定量PCR仪校准规范

JJF(鲁)138-JJF（鲁）138—2022JJF（鲁）138—2022 （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （5） （6） （6） （6） （13） （13） （14） （18） （22）JJF（鲁）138—2022《测量不确定度评定与表示》共同构成支撑校JJF（鲁）138—20221实时荧光定量PCR仪校准规范本规范适用于实时荧光定量PCR仪的校准，其他类型PCR仪相同原理部分可参照本3.1PCR（聚合酶链反应）polymerasec3.2PCR仪（聚合酶链反应分析仪）polymerasechainreactionanalyze对扩增产物量进行定量分析，并通过对荧光的采集3.4温度示值误差temperatureindJJF（鲁）138—202223.5温度均匀度temperatur3.6温度波动度temperature在被检设备稳定的状态下，在规定的时间间隔3.7温度最大过冲量temperaturemaxi3.8平均升温速率mean3.11荧光强度精密度precisionoffluorescenceintensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测扩增过程前3～15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数均热块不同测量孔在同一荧光条件下，阈值3.14熔解温度melttemperature,TmPCR过程中均热块测量孔的荧光强度（纵坐标）与温度（横坐标）JJF（鲁）138—20223.18通道峰值强度一致性channelpeak3.19线性灵敏系数linearsensitivityfactor,LSF注：理想的荧光定量PCR仪，线性灵敏度应该是1.00。LSF在0.80和1.20之间，溶解曲线呈现基本线性；LSF<0.80：在高荧光强度下线性降低，注意信号饱和；LSF>1.20：在低荧光强度下线性降低，注意最小信号检测和灵敏度。3.20熔解温度比ratioofmelttemperature,RTm注：RTm在0.80到1.20之间：相同产品熔解温度不同，差异仅基于控温模块特性，熔解峰漂移与温度不均匀直接相关；RTm>1.20：相同产品熔解温度不同，差异是由控温模块、光学和光学检测系统不准确共同导致的；RTm<0.80：相同产品熔解温度不同，差异是与光学、光学检测系统及分析软件直接相关。3.21样本示值误差errorofsample’sindication实时荧光定量PCR仪，全称为实时荧光定量聚对扩增基因进行定量分析的仪器。标记有荧光染料性、低温复性和适温延伸的热循环后，与模板基因于反应体系中，在特定光激发下荧光染料发出荧光4基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变实时荧光定量PCR仪均热块一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等几种类型，其中96孔板应用最为广泛。其主要由软件控制系统、温度控制模块、荧光检测模块、均热块检测孔组成，详细结构如图1所示。应用于新冠病毒核酸快速检测的仪器检测通量通常不大于16。1—光源2—滤光片3—准直器4—光导束5—样品6—均热块检测孔7—温度传感器8—加热制冷供电9—光开关阵列10—光敏器11—电控装置12—通讯接口13—计算机5计量特性实时荧光定量PCR仪计量性能指标如表1所示。备注1温度示值误差温度项目2温度均匀度3温度波动度4/56JJF（鲁）138—20225续表1实时荧光定量PCR仪计量性能指标7阈值循环数示值误差光学系统物理项目8阈值循环数均匀度9阈值循环数精密度通道峰值强度一致性1±0.2线性灵敏系数1±0.2熔解温度飘移熔解温度比1±0.2样本示值误差光学系统生物化学项目样本线性相关系数≥0.980注：以上所有指标不适用于合格性判别，仅供参考。6项目时，可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理方法中的一种方法进行校准。对校准结果产生疑义或仲裁时，7.2校准方法实时荧光定量PCR仪均热块孔数少于96孔时，测量点为12个，布点图(以48孔为例)如图2所示，均热块孔数为其他数量时，可参照图2布点。实时荧光定量PCR仪均热块孔数等于或大于96点时，测量点为15个，布点图如图3所示，均热块孔数为其他数量时，可参照图3布点。也可以根据被测实时荧光定量PCR仪说明书或客户要求，增加或减校准前将实时荧光定量PCR仪预热30min。将仪器及光学标准器各部件连接完好，在光学标准器下部的温度量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。将光学标准器温度项目校准时，典型的校准设置程序如表2步骤4～11所示(其中平均升、降温速率的测量数据分别来源于步骤4～5和步骤5～6;温度示值误差的测量数据来源于步骤5~11;温度均匀度、温度波动度、温度最大过冲量的测量数据来源于步骤5～10)。光学系统采用物理校准方法时，典型的校准设置程序如表2步骤12～16所示(步骤12和步骤13之间设定程序循环32次)。光学系统采用生物化学校准方法时，典型的校准设置程序如表JJF（鲁）138—2022表2温度项目、光学系统物理项目典型的校准设置程序步骤设定温度点持续时间（s）备注13060预热程序295603306043060温度技术指标校准程序595630790850970603060模拟光学扩增程序：在85℃/60℃之间循环32次，同时进行光学检测。603095扩增变性程序6030熔解曲线分解过程95表3光学系统生物化学项目典型的校准设置程序步骤设定温度点持续时间（s）循环数15012956001395304546060i（1）T——温度示值误差，℃;8JJF（鲁）138—2022 T TTuTmaxTmin（2）T Tmax——所有测温传感器测定值平均值的最大值，℃; Tmin——所有测温传感器测定值平均值的最小值，℃。Tfmax[(TjmaxTjmin)/2]（3）TTjmax——测量点j温度传感器在m次测量中的最高温度，℃;Tjmin——测量点j温度传感器在m次测量中的最低温度，℃。TtTtmax-Ts（4）TJJF（鲁）138—20229TTT/n（5）Tah——平均升温速率，℃/s；TTT/n（6）T精密度按照公式（9）计算Ct值的相对实验标准偏差，以其作为Ct值精密度的表征。CtiCtqiCts（7）JJF（鲁）138—2022RSDCtCtuCtqmaxRSDCtnnCtqii1nnCtm1qiCti——第i个采样测量点阈值循环数Ct示值误差；Cts——荧光信号达到阈值时光学标准器实际经历的循环数；Ctu——阈值循环数均匀度；RSDCt——阈值循环数精密度；CPHCiLSFiBiCiBCABBiCiCPHCi——通道峰值强度一致性；JJF（鲁）138—2022 Ai——第i个采样孔测量熔解LSFi——线性灵敏系数。TTTRTm——熔解温度比；Ttmax——所有采样测量孔实时荧光定量PCR仪的Tm最大值，℃;Ttmin——所有采样测量孔实时荧光定量PCRTJJF（鲁）138—2022ccccs（14）c——样本示值误差，copies/µLcc——仪器测量平均值，copies/µLcs——标准物质标称值，copies/µLrn(CtiCt)(lncilnc)n(CtiCt)2(lncilnc)2r——线性相关系数；Cti——系列稀释标准物质的第i个扩增Ct值； 校准结果应在校准证书（报告）上反映，校准证书（报JJF（鲁）138—2022h)如果与校准结果的有效性和应用有关时，应对被校样品的抽样程序进j)本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明；n)校准证书和校准报告签发人的签名、职务或等p)未经实验室书面批准，不得部分复制证书或报告的声JJF（鲁）138—2022实时荧光定量PCR仪校准原始记录参考格式记录编号：第X页共X页基本信息委托单位名称：委托单位地址：仪器名称：制造厂商：规格型号：出厂编号：校准依据：标准器信息计量标准（器）名称计量标准证书号有效期至计量标准器证书号有效期至测量范围准确度等级标准物质信息标准物质名称型号规格批号量值特性/不确定度证书编号有效日期环境温度：℃环境湿度：%RH校准员：核验员：一、温度示值误差、温度均匀度设定点：次数测量点12345A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（鲁）138—2022记录编号：第X页共X页设定温度点(℃)305060709095测量点实测温度平均值 (℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值(℃)实测最高温度(℃)实测最低温度(℃)温度示值误差(℃)不确定度(℃)温度均匀度(℃)二、温度波动度设定点：次数测量点123456789A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（鲁）138—2022记录编号：第X页共X页Tmax-Tmin305060709095测量点(℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12温度波动度(℃)三、温度最大过冲量、平均升温速率和平均降温速率设定温度点(℃)305060709095最低或最高测量值(℃)温度最大过冲量(℃)平均升温速率(℃/s）平均降温速率(℃/s）四、阈值循环数（Ct值）示值误差、均匀度、精密度（光学系统物理项目）类别荧光定量PCR仪光学标准器光学标准器不同分布位置测量的阈值循环数A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（鲁）138—2022记录编号：第X页共X页阈值循环数示值误差不确定度阈值循环数均匀度阈值循环数精密度（光学系统物理项目）T(℃)T(℃)TAiBiCiAi-BiBi-CiCPHCLSFRTm光学标准器分布位置A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值六、样本示值误差、样本线性相关系数（光学系统生物化学项目）样本值：项目测量值（copies/μL）U2样本示值误差：样本线性系数：JJF（鲁）138—2022设定温度点(℃)305060709095温度示值误差(℃)温度均匀度(℃)温度波动度(℃)温度最大过冲量(℃)平均升温速率(℃/s）50℃→90℃平均降温速率(℃/s）90℃→50℃阈值循环数示值误差阈值循环数均匀度阈值循环数精密度通道峰值强度一致性线性灵敏系数熔解温度漂移(℃)熔解温度比样本示值误差（copies/μL）样本线性相关系数JJF（鲁）138—2022确保与加热模块接触良好。按照仪器说明书或用TTTiT——采样测量孔内温度示值误差，℃;TT根据上述数学模型以及测量方法，其不确定度来源a)测量重复性引入的标准不确定度分量u1；b)温度传感器分辨力引入的标准不确定度分量u1；c)温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2。C.4.1重复性测量引入的不确定度分量u1sp(ykjyj)2j1k1m(n1)JJF（鲁）138—2022ykj——第j个测量点第k次的测量值，℃; yj——第j个测量点测量值的平均值，℃;表C.1温度测量结果次数测量点不同测量点温度传感器测量结果(℃)123456789A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01sp=0.0313℃u10.0134℃C.4.2温度传感器分辨力引入的不确定度u1'JJF（鲁）138—2022者具有一定的相关性，因此在不确定度计算时不量u1'。C.4.3温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2；u20.058℃C.5合成标准不确定度ucc22 u1u2取k2，则：JJF（鲁）138—2022并运行该程序，同时启动PCR扩增光学