《现代分子生物学》第五章-1-转录

第五章转录转录（transcription）是以DNA为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶的催化下，以4种rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。转录是DNA将遗传信息传递给蛋白质的中心环节。在有些RNA病毒中，RNA也可以指导RNA的合成。基因转录：DNAmRNAThefunctionofpolymeraseistocopyonestrandofduplexDNAintoRNA

1957年Crick提出了中心法测(centraldogma)

DNA→RNA→蛋白质

1970Crick又作了部分修改：

DNARNA蛋白质转录过程中，DNA双链中的一条链为模板链（template/antisensestrand），而另一条链为编码链（coding/sensestrand）。转录起始于RNA聚合酶和启动子(promoter)结合之后，转录起始的第一个碱基称为转录起始点(startpoint)

。在RNA聚合酶的作用下合成RNA，至终止子(terminator)终止。由启动子到终止子之间的序列称为转录单位(transcriptionunit)。转录起始点前面的序列称为上游(upstream)，后面的序列称为下游(downstream)。AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA，startingatthepromoterandendingattheterminator

RNA合成和DNA复制的区别（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链成双链；（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物；（4)转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；（5）聚合酶系不同。第一节转录酶和转录因子1960年Weiss等发现RNA聚合酶（RNAPol）。其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5′-3′方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。RNApol和DNApol有2点不同：（1）RNApol没有任何校对功能；（2）能起始新的RNA链。一、原核生物的RNA聚合酶大部分原核生物的RNA聚合酶的结构十分相似，在聚合酶的表面形成一条约2.5nm的通道，是容纳DNA分子的场所。细菌RNA聚合酶的大小约为9.5nm9.5nm16nm。1.大肠杆菌RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶由多亚基组成，全酶组装过程为

2++’+

，分子量为480KDa左右。

亚基与全酶结合疏松，很容易与全酶分离。全酶可以起始RNA的合成，之后亚基从全酶解离下来。BacterialRNApolymerasehavefourtypesofsubunit;α,β,andβ’haveratherconstant

sizesindifferentbacterialspecies,butσvariesmorewidely.

亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动子。另外，亚基还参与RNA聚合酶与一些转录调控因子间的作用。亚基具有与底物（NTP及新生的RNA链）结合的能力。利福霉素可以阻断转录的起始，链霉溶菌素可抑制延伸反应，二者均是通过与亚基的结合而发挥作用的。’亚基可能与模板结合。肝素可与’亚基结合而抑制转录，并且可以和’亚基竞争DNA的结合位点。

亚基和’亚基提供了RNA聚合酶的活性中心，其一级结构与真核生物RNA聚合酶大亚基有同源性。亚基的功能是帮助全酶识别启动子并与之结合。亚基也可被看作一种辅助因子，因此又可称为因子（Sigmafactor）。在转录过程中，RNA聚合酶需要与其他蛋白质辅助因子（转录因子）共同作用，才能保证转录的顺利进行。如转录终止时的终止因子和抗终止因子。大肠杆菌RNA聚合酶多亚基的复杂结构主要是为酶提供了与多种因子相互作用的能力，从而可以识别多种启动子。2.

因子RNA聚合酶要负责所有基因的转录，也就是说要识别所有转录单位的启动子。因此，因子在RNA聚合酶识别启动子的过程中起关键作用。因子的二级结构属于螺旋，是通过识别启动子上的某一序列来控制RNA聚合酶与启动子的结合的。AmapoftheE.coliσ70factoridentifiesconservedregions.Regions2.1and2.2contactcorepolymerase,2.3isrequiredformelting,and2.4and4.2contactthe-10and-35promotorelements.TheN-terminalregionprevents2.4and4.2frombindingtoDNAintheabsenceofcoreenzyme.E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass)Aminoacidsinthe2.4α-helixofσ70contactspecificbasesinthenon-templatestrandofthe-10promotersequence.目前已发现了至少4种因子。在细菌受到外界环境的急剧影响时，会改变所表达的基因，产生因子更替的现象。如环境温度升高时，大肠杆菌会开启rpoH基因的表达，其产物32能识别热激基因的启动子，而正常状态下表达的基因会关闭或表达水平下降。芽孢菌生活周期过程中生活方式的改变也是通过因子的更替完成的。RNApol

执行多种功能(1)识别DNA双链上的启动子；(2)使DNA变性，在启动子处解旋成单链；及再旋酶活性。(3)通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链。(4)聚合NTP活性。(5)最后当它达到终止子时，通过识别终止子停止转录。二、真核生物的RNA聚合酶在真核生物细胞中，共有三类RNA聚合酶，即RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ。它们对鹅膏蕈碱（

-amanitine）的敏感性不同，在细胞核中的定位也有差异。YeastRNApolymerasehasgroovesthatcouldbebindingsitesfornucleicacids.ThepinkbeadsshowapossiblepathforDNAthatis~25Åwideand5-10Ådeep.Thegreenbeadsshowanarrowerchannel,12-15Åwideand~20Ådeep,thatcouldholdRNA.NTPuptakechannelisinthebackchannelsintoandoutoftheopencomplexDNAenteringchannel

B220～240Kda—与模板结合，与链的起始，延伸有关，相当于原核RNAPol的β′亚基C端含有羧基末端功能区 大亚基B140～150Kda—与DNA、底物和新生的RNA结合，相当于原核RNAPolβ

B44.5—酶的连接，相当于原核RNA的α亚基 RNAPolⅡ ABC27KDa磷酸化蛋白，

1类—三种RNAPol共有，如ABC25.5KDa与DNA结合有关

ABC23KDa B12.6

小亚基

2类—PolⅡ特有

B23 B14.5 B10 3类—在某些条件下可除去的亚基 B23 参与酶的基本结构

B16.5 细胞器的RNAPol—和噬菌体的RNA相似，因有单一固定的功能，分子量较小 表12-3真核生物聚合酶的成分及功能 RNA聚合酶Ⅰ位于核仁，活性所占比例最大，负责rRNA（5.8S、18S和28S）的转录。RNA聚合酶Ⅰ负责了大部分细胞RNA的转录。RNA聚合酶Ⅱ位于核质，活性所占比例仅次于RNA聚合酶Ⅰ，主要负责核内不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA/mRNA前体）的转录。RNA聚合酶Ⅲ也位于核质，活性所占比例最小，负责tRNA、5SRNA、Alu序列和其他小RNA的转录。真核生物的RNA聚合酶的分子量都很大，由8至14个亚基组成。经纯化的RNA聚合酶具有以DNA为模板合成RNA的能力，但不能正确地选择启动子。目前尚不能完成RNA聚合酶的体外重建，无法确定哪些亚基是活性所必需的。第二节启动子启动子(promoter)是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合，形成起始转录复合物的区域。启动子上还包括一些调节蛋白因子的结合位点。启动子是控制转录起始的序列，并决定着某一基因的表达强度。与RNA聚合酶亲和力高的启动子，其起始频率和效率均高。一、原核生物的启动子在原核生物的基因组中，能够被RNA聚合酶识别的最小DNA片段为12bp。研究启动子特性的方法之一是比较不同启动子的序列，从中发现一些同源性比较强的部分，又称为保守序列。原核生物启动子（promoter）的结构和特点

(1)典型结构,都含识别（R),结合（B)和起始

（I）位点;(2)序列保守;(3)位置和距离都比较恒定；

(4)直接和多聚酶相结合；

(5)常和操纵子相邻；

(6)位于基因的5′端；

(7)决定转录的启动和方向。

(8)特殊的启动子的R,B序列不同。1.原核生物启动子的结构

典型的原核生物的启动子的结构为：－35区、16～19bp的间隔区、－10区和转录起始点，－10区到转录起始点的距离为7bp

转录起始点

转录起始点在多数情况下为嘌呤，常见的序列为CAT，A为转录起始点。转录起始点左右的碱基也可影响转录的起始。例如，＋1至＋30的转录区可以影响RNA聚合酶对启动子的清除，从而影响启动子的强度。

－10区在转录起始点的上游有一个6bp的保守序列，由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。几乎在目前已知的所有启动子中均存在。保守序列的中心位于转录起始点上游约－10bp处，这一保守序列又称为－10序列。其一致序列为TATAAT，又称Pribnow框、结合位点，在RNA聚合酶的作用下首先解链。

其功能是：

(1)RNApol紧密结合;(2)形成开放启动复合体；

(3)使RNApol定向转录。

－35区又称为Sextama框盒（Sextamabox）。

在转录起始点上游－35bp处，有另一个保守序列，称为－35序列。其保守序列为TTGACA，RNA聚合酶的σ因子可以识别该位点，称为识别位点，

RNA聚合酶首先与识别位点结合，然后与结合位点相互作用。

该区域是启动子强弱的决定因素。其功能是:(1)为RNApol的识别位点。

σ亚基识别-35序列，为转录选择模板(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNApol的结构有关。

－10区与－35区间的距离

－35区和－10区之间的距离在绝大多数原核生物启动子为16到18bp。该区域的碱基序列并不重要，但该距离的长短是至关重要的。适宜的距离可以为RNA聚合酶提供合适的空间结构，便于转录的起始。2.启动子功能的研究方法研究启动子功能的主要方法是启动子的突变。启动子碱基序列发生变化，可以改变启动子的强弱。目前所知，几乎影响启动子功能的所有点突变均发生在两个保守区域内，即－10区和－35区。－

35区的功能是提供RNA聚合酶的识别信号，而－10区是使封闭复合物转变为开放复合物。3.RNA聚合酶与启动子的结合研究RNA聚合酶与DNA之间的识别以及结合常常采用足迹法（footprinting）。经测定，RNA聚合酶与启动子结合的区域为－50至＋20，这段序列包括了结合及起始所需的序列。另一种研究启动子的方法是采用碱基修饰的方法。

可先用碱基修饰试剂对DNA和RNA聚合酶的复合物进行修饰，未与RNA聚合酶结合的DNA，其相应的碱基被修饰。而结合了RNA聚合酶的碱基则不被修饰。这些分析方法可以确定与RNA聚合酶紧密结合的位点。有趣的是，在－10区上游的所有紧密结合位点均位于一条DNA链上。这可使RNA聚合酶从DNA的一个侧面接近并识别启动子并与之结合。OnefaceofthepromotercontainsthecontactpointsforRNA二、真核生物的启动子

1.RNA聚合酶Ⅰ启动子的结构

RNA聚合酶Ⅰ的启动子主要由两部分组成的(bipartite)：核心启动子（corepromoter）位于－45至＋20的区域内，足以使转录起始。上游调控元件（upstreamcontrolelement）位于－180至－107，可提高转录起始效率。2.RNA聚合酶Ⅱ启动子的结构RNA聚合酶Ⅱ主要负责编码蛋白质和部分核内小rRNA（smallnuclearRNA，snRNA）的基因的转录，其启动子结构最为复杂。RNA聚合酶Ⅱ单独并不能起始转录，必须和其他的辅助因子共同作用形成转录起始复合物才能起始转录。RNA聚合酶Ⅱ的启动子位于转录起始点的上游，由多个短的序列元件组成，主要有三个保守序列：（1）帽子位点，又称转录起始位点，其碱基大多数为A，这与原核生物相似。（2）TATA框，位于－30处，又称Hogness框。一致序列TATAA（T）AA（T）。有些TATA框的突变不影响转录的起始，但可以改变转录起始位点。说明TATA框具有定位转录起始点的功能。

（3）CAAT框，位于－75处，一致序列为GGC（T）CATCT。CAAT框内的突变对转录起始的影响很大，决定了启动子起始转录的效率及频率。另外还有GC框（GCbox）、八聚核苷酸元件（octamerelement）等元件。Ⅱ类基因的启动子和调控区

TATA框

核心元件起始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ识别信号。

CAATbox、Ⅱ类启动子上游元件组成GCboxOct

增强子（enhancer）远端调控区减弱子（dehancer）

静息子（silencer）上游激活序列（upstreamactivatingsequencesUASs）

在不同的启动子中，这些元件的组合情况是不同的。各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，而这些蛋白因子共同组合成起始复合物。人类Ⅱ型启动子的基础转录因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依赖模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基 TFⅡB 33K 结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F

相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子 TFⅡE 34K(β)结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和PolⅡ结合，介导其加入复合体 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 识别Inr，起始TFⅡF/D结合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式 TFⅡS RNA合成延伸 3.RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构RNA聚合酶Ⅲ转录5SrRNA、tRNA和部分snRNA。这三种启动子的结构是不同的，RNA聚合酶Ⅲ也必须和其他的辅助因子共同作用，才能识别不同的启动子。5SrRNA和tRNA基因的启动子位于转录起始点的下游，称为内部启动子（internalpromoter）。snRNA基因的启动子位于转录起始点的上游，和其他基因的启动子比较相似。４、研究真核生物启动子的方法研究真核生物启动子结构与功能的方法主要有：缺失、点突变和足迹法。研究启动子的位置及长度用缺失和点突变进行。研究蛋白质辅助因子与启动子的相互作用可采用DNase、足迹法及凝胶阻滞法。第三节终止子在转录的过程中，提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）。无论是原核生物还是真核生物都可以通过控制转录的终止来对转录进行调控。这也是基因表达调控的重要手段。一、原核生物的终止子大肠杆菌和噬菌体中进行的体内和体外实验表明，真正起终止作用的不是DNA序列本身，而是转录生成的RNA。在这一点上，终止子和启动子不同。新生的RNA中可有多处发夹结构。比较不同原核生物的终止子序列，发现其同源性很差。大肠杆菌有两种类型的终止子：1内在终止子（intrinsicterminator）

又称为不依赖ρ因子的终止子。只有核心酶和终止子就足以使转录终止，不依赖其他其他辅助因子的作用。不依赖ρ因子的终止子在结构上有两个特征，一个是转录生成的RNA形成发夹结构，二是发夹结构末端紧跟着6个连续的