生物化学-第二章-蛋白质化学-蛋白质化学

第六节：蛋白质的性质10/17/20241一、蛋白质性质：

胶体性质(p299)

两性性质及等电点

(p291)

蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固

(p233,300)

蛋白质的紫外吸收

蛋白质的分子量

(p291)

蛋白质的呈色反应

二、蛋白质含量测定法(p315)10/17/20242蛋白质分子量大，它在水溶液中所形成的颗粒直径约为1－100nm。胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可以对蛋白质进行纯化，这是提纯蛋白质的一种常用方法。(一)胶体性质10/17/20243在溶液中能形成稳定的胶体的因素极性不电离基团：形成水化层极性电离基团：形成双电子层原因10/17/20244

(二)两性性质及等电点PrCOO-NH3+pH=pI净电荷=0Isoelectricpoint(pI)定义：

在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当,Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零,在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值称为该蛋白质的pI。pH>pI净电荷为负PrCOO-NH2OH-H+pH<pI净电荷为正PrCOOHNH3+OH-H+10/17/20245

蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团除了肽链末端的α-氨基和α-羧基外，主要的还是肽链上氨基酸残基的一些侧链基团，如：

ε－NH2、γ－COOH、β-COOH、咪唑基、胍基、－OH等。10/17/2024610/17/20247

pH=pI时，净电荷为零，在电场中不移动

pH＞pI时，净电荷为负，在电场中向阳极移动

pH＜pI时，净电荷为正，在电场中向阴极移动

在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀.

10/17/20248（三）蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固2.复性1.变性3.沉淀和凝固定义变性因素变性实质变性蛋白质的特点

变性的分类定义沉淀类型10/17/20249吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。1.蛋白质的变性(denaturation)(1)定义：在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构（不包括肽键）被破坏，从而引起若干理化性质改变和生物学功能丧失的现象。10/17/202410变性因素物理因素高温、高压紫外线、X射线、电离辐射和超声波等化学因素有机酸、生物碱有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等10/17/202411变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、MW不变）。10/17/202412变性蛋白质的特点①生物学活性丧失②理化性质改变③易被蛋白酶水解

空间结构改变旋光性、光吸收改变等溶解度↓，沉降率↑粘度↑扩散速度↓10/17/202413变性分类可逆变性:

Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学活性还能恢复，这一过程称为复性（renaturation）不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性质难以恢复。举例：医疗；生物制品保存；生活等。应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老……10/17/202414HOCH2CH2SH

ONH2-C-NH2=

NH2+

NH2-C-NH2=UreaGuanidineHClMercaptoethanolCl-SDSSO4-

-(CH2)11CH3常見的蛋白质变性剂JuangRH(2004)BCbasics10/17/202415极性头部非极性尾巴SDS是一种表面活性剂sodiumdodecylsulfateStryer(1995)Biochemistry(4e)p.27510/17/202416SDS在蛋白质表面均勻铺上一层负电荷SDSboiling变性蛋白質成一线狀分子自然状态蛋白质並且均勻帶上一层负电荷JuangRH(2004)BCbasics10/17/20241710/17/202418核糖核酸酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性10/17/202419去除变性因素后，变性蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象。本质—一级结构决定高级结构2.复性（renaturation）10/17/202420变性蛋白质为什么能复性？

在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。10/17/202421加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固（coagulation）。因此，凝固的蛋白质一定发生变性。

What’scoagulationofprotein?10/17/202422

凝固：变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质)，加热等因素使蛋白质变性并凝聚成块状。总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系变性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定变性变性Pr不一定凝固凝固的Pr一定变性3.沉淀与凝固沉淀：蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称沉淀。10/17/202423

沉淀类型

①

PI法

②盐析法

③

有机溶剂沉淀法④重金属盐沉淀蛋白质⑤生物碱、有机酸试剂沉淀蛋白质⑥加热变性沉淀法⑦抗体对蛋白质的沉淀：10/17/202424机理：夺取蛋白质颗粒上的水化膜，降低溶液的介电常数10/17/202425++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的等电点沉淀

带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）10/17/202426不可逆沉淀

在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀10/17/202427可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。10/17/202428定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半饱和硫酸铵沉淀球Pr

饱和硫酸铵沉淀清Pr优点：Pr不变性，常用。盐析法（Saltingout)(p305)叫分段盐析法10/17/202429蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多H2O，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。盐析（（NH4）2SO4）10/17/202430分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶10/17/202431

大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr、Phe和Trp。这三种AA在280nm

附近有特征性吸收峰。在此波长范围，蛋白质的A280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。此外，蛋白质的肽键在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白质浓度的测定(四）蛋白质的紫外吸收10/17/202432（五）蛋白质的分子量蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10000~1000000d之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。10/17/202433测定蛋白质分子相对质量的方法1.根据化学组成测定最低相对分子质量2.渗透压法：

3.沉降法：超速离心4.凝胶过滤法：5.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：10/17/2024341.根据分子组成测定最小分子量

测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200d，实际为69000d，含2个Trp×100=16700=最小M＝Fe分子量

Fe(%)55.80.335(实为16900马心)如肌红蛋白含0.335%的铁10/17/2024352.据pr的渗透压测蛋白质分子量

10/17/202436用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透压达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：C：浓度（克/升）R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温度）T：绝对温度（开氏温度）

：以大气压表示的渗透压ccTRMrp0lim®=10/17/202437

优点：渗透压法简单、准确(10000-100000d)、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响不足：但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一

.10/17/202438

3、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量p297

10/17/202439

标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。10/17/2024404.SDS—PAGE（十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳）10/17/202441

加入SDS和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。★影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力〔主要因素〕凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小★优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品

缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差）★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量10/17/202442（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。+—-+10/17/202443等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－10/17/202444沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。

s

=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）

x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）超离心法是最准确可靠的确定蛋白质分子量方法。（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50×104g离心力作用下从溶液中沉降下来。3.超离心法10/17/202445蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系M=——————RTsD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系数10/17/202446

反应试剂颜色反应基团有此反应的Pr及AA双缩脲反应

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2个以上肽键所有蛋白质Millon反应

Millon,硝酸，亚硝酸

红色酚基Tyr黄色反应

HNO3及NH3

黄、橘黄

苯基Phe,Tyr乙醛酸反应乙醛酸H2SO4

紫红吲哚Trp坂口反应

次氯酸钠,萘酚红色

胍基

ArgFolin酚试剂反应

CuSO4磷钨酸-钼酸

蓝色

酚基Tyr茚三酮反应

茚三酮

紫蓝色

游离氨、羧基Pro和羟Pro呈黄色（六）蛋白质的呈色反应10/17/202447二、Pr含量测定法

1.微量凯氏定氮法：2.双缩脲法：3.福林-酚(Lowry)法

改良的Lowry法4.考马斯亮蓝法（Bradford法)5.紫外吸收法6.BCA法7.胶体金法10/17/202448

蛋白质含有多个肽键，可发生双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸组成无关。

快速，但不很准确该法测定的蛋白质浓度范围是

1～10mg/ml(g/L)双缩脲法10/17/202449Lowry法

此法是对双缩脲法的发展，首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质的复合物，然后这种复合物及Tyr和Trp残基还原磷钼酸及磷钨酸试剂(福林-酚试剂)，产生深蓝色。

测定蛋白质的含量范围：

500nm0.05～0.5mg/ml750nm0.03～0.3mg/ml10/17/202450改良Lowry法：

在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双缩脲法结合起来，形成两种颜色的混合物，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25

g-250g/ml.

曾经的蛋白质浓度测定标准方法10/17/202451

考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化物，在595nm具有特定吸收

本法反应快，操作简单，灵敏度高，重复性好，消耗样品少，但不同蛋白质之间的差异较大，