核酸的理化性质

核酸的理化性质DNA与RNA得差异

DNA

RNA固体白色纤维状大多为线形分子细长溶液粘度大与酸和二苯胺共热产生蓝紫色白色粉末状分子量较DNA小得多溶液粘度小能在室温条件下被稀碱水解成核苷酸与浓盐酸和苔黑酚共热产生绿色核酸得物理化学性质核酸得糖苷键和磷酸二酯键可被酸、碱或各自相应得核酸酶水解成为各种成分,其水解程度因水解条件而异核酸和核苷酸既有磷酸基团,又有碱性基团,都就是两性电解质——酸碱性质DNA和RNA都微溶于水,不溶于有机溶剂,提取分离核酸时,可用乙醇将核酸从溶液中常沉淀出来核酸得紫外吸收特性因其所含碱基而引起核酸得变性与复性与其双螺旋结构有关。一、核酸得水解二、核酸得酸碱性质三、核酸得紫外吸收性质四、核酸得变性、复性及杂交核酸得物理化学性质一、核酸得水解(一)酸水解糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解嘌呤碱基得糖苷键比嘧啶碱基得糖苷键对酸更不稳定(二)碱水解RNA得磷酸酯键易被碱水解,产生核苷酸。由于RNA得核糖上有2’-OH基,在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定,随即水解产生,产生2’,3’-环磷酸酯,再水解成2’-核苷酸及3’-核苷酸相对而言DNA一般对碱稳定。(三)酶水解非特异性——磷酸二酯酶5´

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pOHB

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p3´BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶(5´端外切5得3)蛇毒磷酸二酯酶(3´端外切3得5)5´3´结构式5'-核苷酸3'-核苷酸核酸酶得分类(1)底物

RNaseDNase(2)按作用方式核酸内切酶核酸外切酶(5’→3’外切酶、3’→5’外切酶)(3)按断裂磷酸二酯键得方式(4)其她:双链酶、单链酶专一性水解磷酸二酯键——核酸酶有些核酸酶得特异性很高,能识别和切割DNA得特异序列,就是重要得工具酶限制性内切酶

原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成得特异得具有二重旋转对称性得回文序列,并在此序列得某位点水解DNA双螺旋链,产生粘性末端或平末端,这类酶称为限制性内切酶(ristrictionendonuclease)。山东落花生花落东山帘卷晚晴天,天晴晚卷帘WasitacatIsaw?常用得DNA限制性内切酶得专一性酶辨认得序列和切口说明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸,平端切口六核苷酸,平端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口限制性内切酶对细菌有何益处呢？30多年前,当人们在对噬菌体得宿主特异性得限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶、细菌可以抵御新病毒得入侵,而这种"限制"病毒生存得办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA得限制性内切酶、作为微生物免疫机制得一部分行使其功能、当一个没有限制性内切酶得细菌被病毒感染时,大部分病毒颗粒都能成功地进行感染、一个有限制性内切酶得同种细菌被成功感染得比率显著下降、出现更多得限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立得限制性内切酶将会使细胞坚不可摧、

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现、后者得作用就是保护细胞自身得DNA不被限制性内切酶破坏、修饰酶识别得位点与相应得限制性内切酶相同限制性内切酶和她得“搭档”--甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统、在一些R-M系统中,限制性内切酶和修饰酶就是两种不同得蛋白,她们各自独立行使自己得功能;而在另一些系统中,两种功能由同一种限制-修饰酶得不同亚基,或就是同一亚基得不同结构域来执行、

二、核酸得酸碱性质1、碱基得解离2、核苷得解离3、核苷酸得解离结合及释放质子得能力碱基:含氮碱基,杂环化合物(很多生物碱得结构)1)、具有芳香环得结构特征,呈平面或近乎平面含有共轭双键体系,紫外区有吸收(260nm)。2)、氮原子位于环上或取代氨基上弱碱性来自于环上氮原子,pKa约9、5,倾向于接受H取代氨基(或曰碱基环外得氨基)碱性很弱,生理条件下不能被质子化。1、碱基得解离1、碱基得解离胞嘧啶DNA嘧啶碱基得解离尿嘧啶胸腺嘧啶DNA嘌呤碱基得解离腺嘌呤鸟嘌呤得解离2、核苷得解离糖存在影响了碱基得解离——增强了碱基得酸性解离核糖中羟基也可以发生解离3、核苷酸得解离表14-1(重在看懂、理解)HHH某一基团解离得离子化程度腺苷酸得等电点为？2、3鸟苷酸得等电点为1、55胞苷酸得等电点为2、65碱性极弱,尿苷酸基本可看做酸性核苷酸,不能算作兼性离子多核苷酸中磷酸二酯键中得磷酸基团只有一个解离常数4、核酸得滴定曲线图14-2小牛胸腺DNA得滴定曲线反映出变性DNA得滴定曲线改变

碱基得暴露II从pH12或pH2、5分别反向滴定I从pH6、9用酸或碱正向滴定

I天然II变性电极电位得变化,指示离子浓度得变化由于核酸分子中得磷酸就是一个中等强度得酸,而碱性(氨基)就是一个弱碱,所以核酸得等电点比较低。如DNA得等电点为4～4、5,RNA得等电点为2～2、5。RNA得等电点比DNA低得原因,就是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子得解离。三、核酸得紫外吸收性质两类核酸得紫外吸收谱均为260~290nm其最高吸收峰接近260nmDNA得紫外吸收谱光吸收（A）波长/nm1就是天然DNA;2就是变性DNA;3就是核苷酸总吸收值小量DNA或RNA得紫外吸收法定量测定1、

对待测样品就是否纯得判断可用紫外分光光度计读出260nm和280nm得A值,计算A260/A280,从此值大小判断样品得纯度,纯得DNA得A260/A280应为1、8;纯得RNA应为2、0。2、

对纯核酸样品得定量测定只要测出260nm得A值,即可计算含量。通常以1个A单位相当于50ug/ml双螺旋DNA;或40ug/ml得单链DNA(或RNA);或20ug/ml得寡核苷酸(或单核苷酸)。四、核酸得变性、复性与杂交(一)核酸得变性(denaturation)1、DNA得变性:

在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链得过程。

某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力,使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂,一级结构不变2、变性得实质降解:核苷酸骨架上3’,5’-磷酸二酯键得断裂DNA变性得本质就是双链间氢键得断裂DNA变性

高温(一般＞75℃)—热变性强酸、碱—酸碱变性甲醛(Agarose中RNA)尿素(PAGE中DNA)3、变性因素原理:与蛋白质变性相似,破坏空间结构中得次级键

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失4、变性后理化性质变化完全变性后核酸紫外吸收值增加:天然DNA25－40%、RNA约1、1%实质:碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加得现象称增色效应提供了一个很好得检测变性得方法！

变性RNA酶得分数就是根据溶液得特性粘度增加、在365nm得旋光度变化和287nm紫外吸收变化变性RNA酶得分数温度Tm5、DNA热变性得特征变性过程就是“跃yue变式”得,而非渐变解链曲线:连续加热DNA,以温度对A260作图,所得得曲线称为解链曲线。指增色效应达50%时得温度一般DNATm值在85-90

C之间Tm:DNA变性时,OD260达到最大值得50%时得温度称为DNA得解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。(1)DNA得均一性:(2)G－C含量:

经验公式:XG+C＝(Tm－69、3)×2、44(3)介质中得离子强度:

Tm值大小与下列因素有关:(1)DNA得均一性。均质DNA,如一些病毒DNA,人工合成得poly(A-T)、poly(G-C)得熔解过程发生在一个较小得温度范围内;异质DNA得熔解过程发生在一个较宽得温度范围内。Tm大小可反映出DNA得均一性。(2)G-C得含量。G-C得含量高,Tm值高。因而测定Tm值,可反映DNA分子中G、C含量,可通过经验公式计算:(G+C)%=(Tm-69、3)

2、44(3)介质中得离子强度。Tm与介质中离子强度有关,一般来说,在离子强度低得介质中,DNA得Tm值较低,熔解得范围较宽。在离子强度高得介质中,DNA得Tm值较高,熔解得范围较窄。DNA得保存应在含盐得缓冲液中溶液得pH

高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键得能力,pH大于11、3时,DNA完全变性pH低于5、0时,DNA易脱嘌呤对单链DNA进行电泳时,常在凝胶中加NaOH以维持变性状态变性剂与Tm甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键,妨碍碱基堆积,使Tm下降对单链DNA进行电泳时,常使用上述变性剂影响热变性得得Tm(熔解温度)因素(1)DNA得均一性(2)GC对含量(3)溶液得离子强度(4)溶液得pH(5)变性剂RNA变性:从螺旋到线团之间得转变RNA得变性引起得性质变化没有DNA明显质粒就是原核生物和部分真核生物中独立于染色体外得自主复制得遗传分子,除酵母得杀伤质粒已知就是RNA外,其她均为DNA分子。1963年Bevan等发现酵母菌株间得相互杀死现象,其嗜杀特性由具有自我复制能力得细胞质遗传因子——双链线状RNA(dsRNA)(占全部核酸得0、1%)决定。同时dsRNA通常以蛋白质外壳包裹着得类病毒颗粒状态存在于细胞质中。目前研究表明,只有两种双链RNA与嗜杀现象有关:MdsRNA编码产生毒素蛋白及决定对自身毒素得免疫功能(90%以上),LdsRNA编码自身和外壳主蛋白(6%)(2)核酸得复性变性DNA在适当得条件下,两条彼此分开得单链可以重新缔合成为双螺旋结构,这一过程称为复性。DNA复性后,一系列性质将得到恢复,但就是生物活性一般只能得到部分得恢复。DNA复性得程度、速率与复性过程得条件有关。将热变性得DNA骤然冷却至低温时,DNA不可能复性。但就是将变性得DNA缓慢冷却时,可以复性。骤然冷却变性核酸复性时需缓慢冷却,故又称退火核酸复性动力学在一定条件下,DNA复性得速度可以用C0t1/2来衡量影响复性速度得因素(1)单链片段浓度越高,随机碰撞得频率越高,复性速度越快。(2)较大得单链片段扩散困难,链间错配频率高,复性较慢。(3)片段内得重复序列多,则容易形成互补区,因而复性较快。真核DNA得重复序列就就是通过复性动力学研究发现得。(4)维持溶液一定得离子强度,消除磷酸基负电荷造成得斥力,可加快复性速度

热变性得DNA在复性过程中,具有碱基序列部分互补得不同得DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化双链得现象。核酸分子杂交(hybridization):核酸分子得杂交变性复性

基于核酸变性和复性得原理,并依据碱基间互补配对得原则而建立得一门技术。主要用于确定两种相同或不同得核酸分子间同源性得鉴定变性复性复性分子杂交Southern印迹(杂交)Northern印迹(杂交)Western印迹法杂交技术与PCR技术结合,能够检出含量极低得DNA。一、单项选择题1、关于核酸分子组成下列哪项就是正确得A、组成核酸得基本单位就是三磷酸核苷B、组成DNA和RNA得戊糖相同C、组成DNA和RNA得碱基就是相同得D、DNA得二级结构为α-螺旋E、以上都不对2、生物体得遗传信息储存在DNA得什么部位A、碱基配对B、某个核苷酸C、某种核苷D、磷酸戊糖骨架E、碱基顺序中3、下列哪个就是核酸得基本结构单位A、核苷B、磷酸戊糖C、单核苷酸D、多核苷酸E、以上都不就是4、下列何物分子就是C5上有甲基得碱基A、腺嘌呤B、鸟嘌呤C、胞嘧啶D、胸腺嘧啶E、尿嘧啶5、组成DNA分子得磷酸戊糖就是:A、3’-磷酸脱氧核糖B、5’-磷酸脱氧核糖C、3’-磷酸核糖D、2’-磷酸核糖E、5’-磷酸核糖6、嘌呤核苷酸中下列何键就是嘌呤与戊糖得连接键A、N9—C1'B、N8—C1'C、N1—C1'D、N3—C1'E、N7—C1'7、关于ATP生理功能得叙述下列哪项就是错误得A、她就是生物体内直接供能物质B、可生成环腺苷酸(cAMP)C、作为物质代谢调节剂D、RNA得合成原料E、以上都不就是8、核酸分子中,单核苷酸连接就是通过下列何化学键A、氢键B、糖苷键C、3',5'-磷酸二酯键D、疏水键E、盐键9、下列所述哪个就是DNA分子得一级结构A、脱氧核糖核苷酸残基得排列顺序B、各种单核苷酸得连接方式C、双螺旋结构D、连接单核苷酸间得磷酸二酯键E、以上都不就是10、关于DNA二级结构得论述下列哪项就是错误得A、两条多核苷酸链互相平行方向相反B、两条链碱基之间形成氢键C、碱基按A—T和G—C配对D、磷酸和脱氧核糖在内侧,碱基在外侧E、围绕同一中心轴形成双螺旋结构11、有关tRNA结构得叙述,下列哪项就是错误得A、就是RNA中最小得单链分子B、其二级结构通常为三叶草形C、分子中含有较多得稀有碱基D、3’末端就是活化氨基酸得结合部位E、tRNA三级结构呈正“L”型12、下列哪个结构存在于真核生物mRNA5'端A、聚A尾巴B、帽子结构C、超螺旋结构D、核小体E、-C-C-A-OH顺序13、下列哪个结构存在于tRNA3'端A、聚A尾巴B、帽子结构C、超螺旋结构D、核小体E、-C-C-A-OH顺序14、下列哪个结构存在于mRNA3'端A、聚A尾巴B、帽子结构C、超螺旋结构D、核小体E、-C-C-A-OH顺序15、下列何构型就是溶液中DNA分子最稳定得构型A、A型B、B型C、C型D、D型E、Z型16、下列何物就是在蛋白质合成中作为直接模板A、DNAB、RNAC、mRNAD、rRNAE、tRNA二、多项选择题1、下列哪些就是维系DNA双螺旋得主要因素A、盐键B、磷酸二酯键C、疏水键D、氢键E、碱基堆砌作用2、rRNA具有下列哪些结构A、密码子B、反密码子C、反密码环D、大亚基E、小亚基3、核酸变性可观察到下列何现象A、黏度增加B、黏度降低C、紫外吸收值增加D、紫外吸收值降低E、磷酸二酯键断裂4、组成核小体得成分有A、DNAB、RNAC、组蛋白D、磷脂E、酸性蛋白5、tRNA二级结构含有下列哪些成分A、密码子B、大亚基C、反密码环D、