自动生化分析仪分析技术

自动生化分析仪分析技术目前绝大部分临床生物化学检验项目已实现自动化其中大多数由自动生化分析仪完成该仪器以紫外－可见光分光光度法为主要检测原理目前较多大型仪器也组合了离子选择电极模块利用散射比浊、电化学、电泳和色谱等技术得检测项目,由其她相应得自动分析仪完成,在第八章中叙述

自动生化分析仪(automaticbiochemicalanalyzer)

提高质量和速度减轻劳动强度节约样品和试剂有利于标准化

操作步骤程序化电脑控制自动进行取样、加试剂、混匀保温反应、吸光度检测结果计算、可靠性判断数据显示、打印、传输清洗等目录

自动生化分析仪概述（了解和熟悉）1自动生化分析仪的分析技术（掌握）2自动生化分析仪的操作方法（了解）3自动生化分析仪性能评价（熟悉）4小结与展望5返回总目录第一节自动生化分析仪概述

已发展50多年,可分为:

连续流动式(continuousflowstyle)

分立式(discretestyle)

离心式(centrifugationstyle)近十余年增加:分析前自动化处理模块分析后自动化处理模块分立式(discretestyle):目前最常用干化学(drychemistry)分析系统:急诊等领域应用普遍

本节内容一、自动生化分析仪得发展历史二、分立式自动生化分析仪得分析原理三、干化学分析系统一、自动生化分析仪得发展历史(一)连续流动式自动生化分析仪(二)分立式自动生化分析仪(三)离心式自动生化分析仪(四)自动化样品前处理系统(五)自动化样品后处理系统(六)模块式分析系统(七)全实验室自动化(一)连续流动式自动生化分析仪1957年第一台,Skeggs医生提出方案,Technicon公司设计仪器组成:样品盘:样品集中放置在能转动得样品盘上比例泵:将样品和试剂按比例吸取得装置透析器:去除蛋白质,制备无蛋白滤液反应管道:样品和试剂混合和反应均在其内混合器:使管道内样品和试剂混合得装置恒温器:能加热反应,可达90℃检测器:吸光度测定、光电转换和信号检测注:1960年代前许多生化测定需采用无蛋白滤液和较高温度自动稀释器流动比色杯示意图连续流动式自动生化分析仪部件连续流动式自动生化分析仪特点:样品与试剂在一条连续管道内进行化学反应并检测不同样品间得交叉污染采取空气隔绝得措施来避免

管道(通道):通常一个管道只能测定一个项目单通道和多通道式:根据管道数量而分

通道数:目前在广义上就是指分析仪能同时测定得项目数

应用:就是20世纪50~80年代市场占有率最高得仪器

由于通道少、分析速度慢、试剂浪费大,逐渐被淘汰(二)分立式自动生化分析仪第2代自动生化分析仪交叉污染小,形式多样、灵活已普遍应用

详见本节二

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静(三)离心式自动生化分析仪第3代分析仪,20世纪70年代初期设计运行特点:样品和试剂分置于转盘中各自相应得凹槽内,样品在外侧,试剂在内离心使内侧试剂受离心力甩向外侧凹槽内,与样品相互混合发生反应一定时间后流入转盘外圈得比色凹槽内由光度计检测缺点:同一个离心盘一般同时分析一个项目反应盘中得凹槽无自动清洗功能分析速度慢应用:20世纪70~80年代在中国非常流行

因其缺点故应用逐渐减少离心式分析仪工作原理离心式分析仪现用于凝血功能指标检测离心式分析仪转盘加样针加试剂针能独立工作

或连接在自动生化分析仪之前

组成:样品投入部离心分离部开盖部在线分注部条码(barcode)生成及粘贴部功能:能避免血清分离、分装、识别等环节得差错(四)自动化样品前处理系统收纳部离心部开栓部在线分注部非在线分注部贴条码部闭栓部样品分注收存部接收部自动化样品前处理系统:样品投入部离心分离部开盖部在线分注部条码部MODULARPRE-ANALYTICSMODULARANALYTICS

模块组合加前处理Beckman

前处理系统Beckman前处理系统

机械臂开塞(五)自动化样品后处理系统主要功能:样品加盖和低温储存组成:关盖部、样品分注收存部、样品接收部

广义得样品检测后处理还包括结果审核、可疑结果复查、结果输出等实验室信息系统(laboratoryinformationsystem,LIS)可实现以上功能样品接收部(六)模块式分析系统20世纪90年代中期开始推出由相同或不同得两台或两台以上分析模块组合连接:

基于光度法分析原理得生化分析模块基于离子选择电极原理得电解质分析模块基于免疫发光分析原理得免疫分析模块

各分析模块既有各自控制系统又有共用得控制系统样品通过传送带在各模块之间进行传递模块式分析系统又称为组合式自动分析仪模块式分析系统日立7600全自动生化分析仪自动分析仪样品传送轨道(七)全实验室自动化

(totallaboratoryautomation,TLA)指实验室得各种操作过程均实现自动化

将各种相关得自动化分析仪器串联起来

组合成流水线式得作业,把样品输送到不同得检测单元

并将各个仪器得检测结果合并输出组成:样品前处理系统样品输送系统样品检测单元不同检测原理得各检测单元往往需由同一公司生产以同一标准来连接,通过计算机控制运行血细胞系统凝血系统生化系统免疫系统HitachiTLA东京大学附属医院TLA采血管准备系统:病人编号、资料血液凝块检测单元可移动机器人连接单元自动平衡离心机样品性状检测－再离心化学－免疫自动化仪器单元尿液分析单元血糖和糖化血红蛋白检测单元血细胞计数单元二、分立式自动生化分析仪得分析原理分立式自动生化分析仪完全模仿手工操作方式设计特点:各检测项目在各自独立得反应杯中进行反应杯具有试管功能,同时又兼做比色杯

分立式全自动生化分析仪贝克曼LX20生化分析仪HitachiClinicalChemistryAnalyzer

7600系列雅培Architectc8000分立式分析仪基本结构

(一)样品盘或样品架－－－(待测样品和试管架)(二)试剂室和试剂瓶－－－(试剂架和试剂瓶)(三)反应杯和反应盘－－－(试管和试管架)(四)取样和加试剂装置－－(进样器和刻度吸管)(五)混匀与搅拌装置－－－(手工混匀和漩涡振荡器)(六)温控和定时系统－－－(恒温水浴和定时钟)(七)光路和检测系统－－－(比色计)(八)数据处理系统－－－－(计算器或电脑)(九)清洗系统－－－－－－(试管清洗)(一)样品盘或样品架(specimendiscorrack

)样品盘放置样品杯或不同规格采血试管得装置放置样品数多,转动后使不同样品到特定位置进样样品盘(俯视图,日立分析仪)样品架一台仪器有许多个,每个放置5或10只样品杯或试管

经传送带移动样品到特定位置进样样品架上得条形码或底部编码孔

识别样品架号及样品位置号有些仪器有专用于

急诊样品、校准品、质控品等

得可识别架

OLYMPUS生化分析仪得样品架空白架校准架质控架常规架贝克曼LX20生化仪样品架样品架得优点①随着样品架移动及样品得被检测,可不断追加已放置样品杯或采血试管得样品架②通过样品架得移动能将样品传送到另一个分析模块甚至另一台分析仪上再进行分析

OLYMPUS生化仪上等待分析得样品样品架及其在轨道中得运行雅培C8000常规样品盘位置常规样品位和急测样品位雅培C8000分析仪急测样品位优先顺序分别为:机上转盘,急诊/优先位,常规位机上转盘急诊优先位急测样品位日立7600生化仪条形码(barcode)

标本条形码:样品杯或采血试管上包含样品信息得条形码包含信息如编号、患者资料、标本类型、检测项目等

样品架条形码或底部编码孔试剂瓶条形码分析仪上能安装条码识别器阅读条码上信息(二)试剂室(reagentchamber)和试剂瓶试剂室:具有冷藏功能(1)试剂转盘式:放置一定形状试剂瓶,数量不等试剂盘转动可使某个试剂瓶到达特定得试剂吸取位置(2)试剂架形式:放置大容量任意形状得试剂瓶由每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴不同试剂间无交叉污染大型分析仪通常有第一和第二试剂室个别分析仪具有加入第三试剂得功能外圈为第一试剂,内圈为第二试剂日立7600生化仪P模块试剂仓奥林帕斯AU2700试剂仓(盖子打开后)试剂盘样品盘加样机构加试剂机构清洗机构搅拌机构反应盘反应杯日立7170生化仪光学系统压电搅拌清洗机构

ISE模块—检测Na+、K+、Cl-165个反应杯试剂位R1、R2雅培C8000生化仪工作面R1R2(三)反应杯(reactioncuvette)和反应盘反应杯:就是样品与试剂进行化学反应得场所由透光性好得硬塑料或石英玻璃制成容量160µl～500µl不等,厚度0、5cm～1cm

同时用作比色杯反应盘:由100只或更多得反应杯围成一圈组成

有些分析仪具有两圈反应杯

反应盘作恒速圆周运动,转动到某些特定位置时短暂停止,在反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀反应杯与反应盘(一体化)美国TECHNICONRA系例生化仪双圈比色杯组(分内圈和外圈)日立反应杯组AU2700C8000外圈内圈(四)取样和加试剂装置1、取样装置

组成:取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门取样容量:一般为2µl～35µl,步进0、1µl不等交叉污染:在吸取不同样品时可产生携带交叉污染防止措施:对样品针内外壁进行水冲洗化学惰性液隔绝样品与取样针内外壁特殊功能:液面感应:取样针尖上设有电子感应器防撞装置:遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警阻塞报警:某些取样针有取样装置日立7170生化仪加样针奥林帕斯AU2700加样针2、加试剂装置组成:类似于取样装置(多数)取试剂量:一般为20µl～380µl,步进1µl～5µl不等交叉污染:在吸取不同试剂时可产生携带交叉污染防止措施:对试剂针内外壁进行水冲洗特殊功能:

液面感应防撞装置预热试剂第一试剂第二试剂反应盘清洗搅拌加试剂机构加样品机构奥林帕斯AU2700灌注式加试剂装置每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴优点:不存在各试剂间得交叉污染缺点:管路通常较长,试剂死腔较大管路中试剂无低温保存日立7600生化仪灌注式加试剂装置反应盘(五)混匀装置反应杯里得样品与试剂需要混匀混匀方式:搅拌混匀:用搅拌棒(stirringrod),多数超声混匀:可杜绝携带污染,极大程度减少泡沬产生搅拌棒混匀搅拌棒形状:扁平棒状或扁平螺旋状,表面疏水材料工作方式:旋转式搅拌震动搅拌防交叉污染:水洗C8000搅拌机构压电型搅拌奥林帕斯AU2700搅拌机构反应盘反应杯搅拌机构日立7600生化仪D模块搅拌机构日立7170生化仪搅拌棒试剂针试剂针清洗剂试剂室反应盘(六)温浴系统反应杯需浸浴在规定温度中,温度波动不能大于±0、1℃

一般固定在37℃温浴方式:水浴:升温速度快,温度稳定需加防腐剂保持水洁净,并要定期更换循环水空气浴:受环境温度影响较大,保养简单恒温液:循环间接加热法,兼具有空气和水浴得优点无污染、惰性得不蒸发液体用很小缝隙得空气把比色杯与恒温液隔开(七)光学检测系统由光源、单色器和信号检测系统组成单色器:常采用光栅,选择10～12种固定得单色光

分光方式:

前分光:光源→分光元件→单色光→反应液→检测器

后分光:光源→反应液→分光元件→单色光→检测器后分光:分光后取多个固定单色光同时通过各自得信号传送通路(如光导纤维)传输到对应得信号检测器

优点:单色器中没有转动部分,提高了检测精度和速度日立生化分析仪得可选比色波长:340、405、450、470、505、545、570、600、650、700、750、800nmOLYMPUS生化分析仪得可选比色波长:340、380、410、450、480、520、540、570、600、660、700、750、800nm雅培C8000生化分析仪可选择波长:340、380、404、412、444、476、500、524、548、572、604、628、660、700、748、804nm信号检测系统光信号→光敏二极管→电信号→放大电路→模数转换电路→数字信号→微处理器按各测定项目得分析参数选择其波长得吸光度值可选择1或2个波长(八)清洗系统样品针、试剂针和搅拌棒得随时清洗

在用于下一个样品、试剂或反应杯前需清洗一次

多数为去离子水冲洗反应杯得随时清洗

多数全自动生化分析仪具有反应杯清洗装置

一个反应杯内得化学反应和吸光度检测结束后

该反应杯就被冲洗系统及时冲洗

冲洗过程:废液针吸走杯内废液→加清洗剂洗涤并抽干→数次去离子水冲洗及抽干→吸光度检查批检测完成后得自动清洗通常为清洗剂(detergent)清洗日立7170生化仪样品针清洗日立7170生化仪搅拌棒试剂针试剂针清洗剂试剂室反应盘试剂针外壁清洗站清洗站反应杯反应盘样品针反应杯清洗机构日立7600分析仪D模块样品杯清洗针示意图比色杯清洗剂或纯水2防溢出3废液1反应杯清洗机构AU2700(九)计算机控制系统控制样品测定程序计算测定结果判断结果准确性显示和输出测定结果数据储存等三、干化学分析系统干化学分析技术利用固相试剂(干片试剂)测定方式:在干片试剂上滴加液态样品载体上试剂溶解并与与样品中待测成分发生反应测定检测信号得反射光强度“干化学”技术就是相对于经典得“湿化学”技术而言实际上就是在一定潮湿状态下得化学反应(一)干化学分析仪干化学仪分析仪与配套试剂组成一个检测系统包括:血糖仪尿液化学分析仪全自动干化学分析仪:急诊化验室常用不同仪器随试剂检测原理不同采用不同监测器半自动干化学分析仪干化学试剂(正面与反面)(二)干化学试剂片1、反射光度法5层结构目前普遍采用胶片涂层技术制备成得多层膜干试剂片①渗透扩散层:样品迅速均匀渗透,阻止颗粒成分和蛋白质等大分子向下渗透②反射层:白色不透明层,下侧涂布反射系数>95%得物质如BaSO4,能隔离渗透扩散层中有色物质③辅助试剂层:去除血清中得内源性干扰物,如固定维生素C氧化酶以消除血清中维生素C对H2O2得还原作用④试剂层:即反应层,固定了该检测项目所需得试剂⑤支持层:透明塑料基片,允许反射光完全透过,而样品浓度与反射光强度成反比试剂层和支持层之间可加一吸水层加快样品和试剂得渗透速度基于荧光反射光度法得多层膜根据免疫竞争反应原理,主要用于半抗原如药物浓度测定膜结构主要分四层扩散层:含缓冲液、表面活性剂,及固相抗体与荧光标记半抗原结合得复合物,并只允许小分子物质如半抗原通过光屏层:含氧化铁可阻止荧光标记半抗原被激发信号层:激发光可作用于反应产物基片层:起支持作用样品中半抗原进入扩散层,竞争性结合固相抗体,使一部分荧光标记半抗原被置换下来成为游离荧光标记半抗原,并通过光屏层进入信号层;在激发光得作用下,由于光屏层得阻遏作用,仅信号层得荧光标记半抗原可被激发产生荧光2、基于差示电位法得多层膜常用于无机离子K+、Na+、Cl-等得检测5层结构:

离子选择敏感膜、参比层、氯化银层、银层和支持层电极:

样品电极

参比电极测定方式:取一定量血清加到样品电极得加样槽中,再取等量参比液加入参比电极得加样槽中,通过电位计来测定这两个电极得差示电位返回章目录一、常用分析方法(一)终点法(二)连续监测法二、分析参数设置(一)基本分析参数(二)特殊分析参数(三)分析参数设置举例第二节自动生化分析仪得分析技术

两类基本分析方法各种分析仪上得一些其她方法,均可归于这两类之中如一点终点法、两点终点法、两点速率法等任何方法均以一定间隔时间测定化学反应全过程吸光度值一、常用分析方法终点法连续监测法正向反应:吸光度升高负向反应:吸光度下降正向反应负向反应时间-吸光度曲线

吸光度随时间变化得曲线称为时间-吸光度曲线

测定吸光度得时间点称为测光点

用于计算结果得测光点称为读数点

(一)终点法(endassay)概念:被测物在反应过程中被转变为产物后,化学反应达到终点或平衡点,根据终点吸光度得大小求出被测物浓度,称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。终点法A变化特点:终点或平衡点吸光度基本不变透射比浊法:抗原和特异性抗体产生浊度反应,浊度具光吸收能力,在生化分析仪中为透射比浊,采用终点法。1、一点终点法(onepointendassay)以时间-吸光度曲线上A基本不再改变时得第33个测光点为读数点

计算公式:

Cu=(Au)n×Cs/(As)n

Cu、Cs为待测物和校准液浓度

(Au)n、(As)n为待测物和校准液终点ACs/(As)n为校准K值2、两点终点法(twopointendassay)在时间-吸光度曲线上选择两个读数点计算公式:Cu=[(Au)n-a×(Au)m]×校准K值

a为反应液体积校正系数

a=(Vs+Vr1)/(Vs+Vr1+Vr2)

Vs、Vr1、Vr2分别表示样品、

第一试剂和第二试剂得体积

目前全自动生化分析仪均具有自动校正反应液体积得功能校准K值=Cs/[(As)n-a×(As)m]两点终点法与双试剂法两点终点法常应用于具有双试剂得测定项目中双试剂法:即具有两种试剂得方法第一试剂通常只含缓冲液等成分,与样品不起特异性反应因此第二试剂加入前得读数点吸光度相当于样品空白第二试剂与待测物起反应并经一定时间反应到达终点终点测光点为第二读数点如图7-2中,第二试剂在第16点和17点之间加入

则通常取第16点Am为第一读数点

第33点即最后1个测光点An为第二读数点两点终点法得作用能有效消除样品造成得光吸收干扰如溶血(hemolysis)、黄疸(icterus)和脂浊(lipo-turbid)等酶法GLU、TC、TG、UA、CR等化学法TP、TB、DB、Ca、Pi、Mg、Fe等且都能在加R2后2～5min内达反应终点

故可设定两点终点法单试剂型得项目只能选择一点终点法

固定时间法(fixed-timeassay)为终点法中得特殊情况在时间-吸光度曲线上选择得两个读数点

既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,其差值用于结果计算固定时间法可解决某些化学反应得非特异性问题例如:苦味酸法测定肌酐反应最初30s,血清中快反应干扰物(如维生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦味酸反应在第二个30s,碱性苦味酸主要与肌酐反应

且此段时间－吸光度曲线得线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐)在80s～120s及其以后,碱性苦味酸可与蛋白质以及其她慢反应干扰物反应

故选用30s～80s这段固定时间为测定时间(二)连续监测法(continuousmonitoringassay)又称速率法(rateassay)用于酶活性和酶法代谢物测定连续选取时间-吸光度曲线中线性期内>4个测光点为读数点

并以其单位时间A值(ΔA/min)计算结果正向连续监测法

负向连续监测法线性期各测光点之间得吸光度差值相等得时期图中δ2＝δ3＝δ4,而δ1及δ5值偏小,故A1点至A4点为线性段此线性期对酶促反应得底物来说属零级反应,期间得ΔA/min即为酶促反应得初速度,其大小与被测酶活性成正比连续监测法得优点即就是可确定线性期,准确计算酶活性,因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法连续监测法结果计算公式酶活性(U/L)＝ΔAu/min×K值代谢物浓度Cu=ΔAu/min×校准K值

校准K值=Cs/(ΔAs/min)酶活性测定公式中得K值包括

理论K值

实测K值

校准K值1、理论K值酶活性计算公式

若某酶活性测定没有可用得校准品

则由酶活性得国际单位定义推算得出:酶活性(U/L)=ΔA/min×ε:指示物质得摩尔吸光系数,b:比色杯光径

VT:反应液总容量,Vs:样品容量

自动生化分析仪得b一般会自动校正为1指示物质常为NADH(NADPH)和对硝基酚类等

在一定测定条件下得ε已被测定获知,试剂说明书均会提供因此公式中可计算得出即为理论K值,又称计算因子,作为分析参数输入分析仪中如NADH(NADPH)、对硝基苯酚和对硝基苯胺在405nm得理论ε分别为6220、18700和9870L·mol-1·cm-1因酶校准品制备和保存困难,故早期几乎所有酶活性测定项目没有校准品,因而多数采用理论K值理论K值2、实测K值理论K值受样品和试剂得加量准确度、比色杯光径准确度,尤其就是ε得影响ε在波长和温度等不同时有所不同

试剂说明书得ε可能与实际所用分析仪所测不同

因而有必要获得用户所用分析仪得实际ε,再计算K值

此为实测K值(1)还原型辅酶得ε测定NADH(NADPH)没有标准纯制品,配成溶液后稳定性又较差,故不能直接用NADH或NADPH标准液测定εHK法测定葡萄糖,葡萄糖消耗与NADH生成呈等摩尔关系根据A=εbC,已知b和Cs测得As便可计算NADH(NADPH)得ε例如C为10mmo1/L(0、01mol/L),Vs3、5µl,Vr335µl,b0、7cm,340nmA为0、465,则实测εNADH＝6424就就是说此台分析仪上340nm波长处NADH(NADPH)得实测ε为6424,而理论上NADH(NADPH)得ε为6220利用该实测ε即可计算实测K值(2)色素原底物酶促产物得ε测定有许多酶底物为人工合成得色素原,其本身无色,经酶作用后释放出黄色得反应产物,在405nm波长具有吸收峰最常用色素原底物及其产物为:

ALP:底物磷酸对硝基苯酚(4-NPP)

产物对硝基苯酚(4-NP)

GGT:底物γ-L-谷氨酰对硝基苯胺

或γ-L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺

产物对硝基苯胺

或5-氨基-2-硝基-苯甲酸色素原底物酶促产物得ε测定测定试剂:①10mmo1/L

4-NP标准储存液②2、5mmo1/L

4-NP标准应用液,0、84mol/LAMP缓冲液稀释③底物缓冲液(l5mmol/L4-NPP配于0、84mol/LAMP-HCl缓冲液中,37℃,pHl0、09土0、02)实测ε4-NP＝若测得ΔA为0、460,则:测定方法:4-NP标准应用液5µl,底物缓冲液350µl,波长405nm,光径0、7cm,温度37℃,测得A1;另用蒸馏水代替4-NP标准应用液,按上述方法测得A2,4-NP标准液吸光度ΔA=A1－A2＝186623、校准K值酶校准液在分析仪中测定后可自动计算得出校准K值校准K值=(酶活性U/L)s/(ΔA/min)s目前,已得到公认得酶校准品已越来越多,包括ALT、AST、LDH、ALP、GGT、CK、AMY等。酶校准品应具有溯源性,并与所用试剂相配套。酶活性测定过程中得分析条件如温度、样品和试剂加量以及吸光度检测等,可发生波动或偏差,如同时进行校准液测定,可同等程度地影响校准液和待测样品,因此使用校准K值通常优于理论K值和实测K值。实测K值得得出较麻烦,且一般仅做一次性测定。二、分析参数设置(analysisparameters)分析参数:自动生化分析仪需要如手工操作类似得分析参数,比如样品加量、试剂加量、分析波长、分析方法等封闭通道:某些分析仪使用配套试剂时,其分析参数已存储在分析仪得硬盘中,用户不能更改,这些项目称为封闭通道开放通道:允许用户修改或设定分析参数得分析项目分析参数分类:基本分析参数:若缺乏即无法测定项目特殊分析参数:与保证测定结果得准确性有关,即使不设定也能测定项目。在不同分析仪上差别很大(一)基本分析参数1、试验名称(testname):测定项目标示符,常为英文缩写2、分析方法(measuringmethod)或方法模式(assaymode):

基本方法为终点法和连续监测法,其她方法均与这两类方法有关3、测定波长(primarywavelength):可选择单波长或双波长(1)主波长(primarywavelength):被检测物吸收峰处波长应选择离被测物吸收峰最近处,尽量避开试剂光吸收等干扰(2)次波长(secondarywavelength)使用次波长目得:①消除噪音干扰噪音:从光源到比色杯、单色器、检测器整个光路均可产生因双波长同时检测,两种波长检测产生得噪音基本上相同

②减少杂散光影响③减少样品本身光吸收得干扰如溶血、黄疸和脂浊等干扰可部分消除

次波长设置原则:使干扰物在主、次波长处有尽可能相同得光吸收值而被测物在主、次波长处得光吸收值有较大差异次波长一般大于主波长100nm,主要考虑脂浊问题免疫比浊法测定时次波长得选择,则就是距离主波长越远越好,以得到较高得灵敏度采用理论K值测定酶活性:

有些指示物在次波长也有明显得光吸收,ε必须进行修正指示物主波长ε次波长εNADH3406、22×1033801、33×103对硝基苯酚4041、89×1044760、2×103对硝基苯胺40410、1×1034760、1×103DTNB40413、2×1034762、8×1034、

反应方向(responsedirection):正向反应和负向反应5、样品量(samplevolum):第一试剂量和第二试剂量根据分析仪可加样体积范围可加试剂体积范围反应液总体积范围将样品量得常量设置到较小量(其减量可至最小加样量)再按试剂说明书规定得试剂样品体积比确定第一和第二试剂量三者总体积需在反应液总体积范围内6、第二试剂(R2)加入时间

样品和R1加入时间定在反应开始时,R2时间不同分析仪有所不同某些分析仪只有一个固定时间,有些分析仪则有两个时间点可选可根据待测物化学反应情况也即时间-吸光度曲线得线形而定多数情况选择较早加入R2以利于终点法确实到达终点,连续监测法延滞期和线性期足够少数情况较迟加入R2如选择性抑制法测定HDL-C,R1与血清中非HDL需充分反应使其受抑制,这个过程需要3min～5min又如免疫抑制法测定CK-MB,R1中得抗体抑制M亚基需一定时间7、终点法读数时间一点终点法:时间-吸光度曲线最后一个测光点两点终点法:分别为R2加入前得测光点和最后一个测光点8、速率法读数时间

(1)延迟时间(delaytime):速率法中从样品与反应试剂混匀开始至进入线性期所需得时间存在原因:内源性干扰物或抑制剂。延迟时间可因酶所存在介质不同而略有差异确定原则:多观察几例浓度不等、病理情况不同得样品得时间-吸光度曲线,选择延迟时间最长者作为确定值(2)读数时间(readtime):需在时间-吸光度曲线得线性期内,在延迟时间之后即开始选择整个线性期内测光点或稍短于线性期,常1、0～2、5min测光点不应少于4个(3个吸光度变化值)试验名称、分析方法、测定波长、反应方向、样品量与试剂量、第二试剂加入时间、终点法得读数时间、速率法得延迟时间和读数时间这8类参数就是最主要得基本分析参数此外还有两大类基本参数,包括校准参数和质控参数,也必需设定,分析仪才能进行测定操作9、校准参数自动生化分析仪以紫外可见光分光光度法为分析技术,根据朗白-比尔定律,待测物浓度需与校准液(标准液)浓度比较来确定计算公式:终点法:待测物浓度Cu=Au×校准K值

速率法:待测物Cu=ΔAu/min×校准K值

酶活性(U/L)=ΔAu/min×校准K值校准K值:待测物校准K值＝Cs/As(或ΔAs/min)

酶活性校准K值＝酶活性s/(ΔA/min)s校准(calibration):对校准液吸光度检测并计算K值得过程校准液浓度或酶活性已知,测得校准液吸光度后即得校准K值1点校准:校准曲线呈直线且过坐标零点,用1个浓度校准液2点校准:校准曲线呈直线但不过零点,需用2个浓度校准液多点校准:校准曲线呈非线性需用3个以上浓度校准液

免疫比浊法得校准曲线一般呈非线性

非线性校准曲线可采用多种曲线方程拟合抛物线型采用logit方式:

按校准液个数选择logit(3p)、logit(4p)或logit(5p)校准曲线线形不确定或呈S型,用splain(样条函数)方式(1)校准类型和

校准液个数抛物线型S型(2)校准液位置和校准液浓度每个校准品均需设定其在样品盘或样品架上得专用位置各检测项目得校准液浓度需输入分析仪校准品需要与试剂、最好与分析仪都配套,如有可能应溯源到参考方法或参考物质

因此,一个测定项目按其所用试剂对应于一个校准品若多个测定项目使用同一品牌得试剂,则该试剂公司可能制备多项目得混合校准品10、质控参数临床生化所开展得定量检测项目通常均需做室内质控每个项目一般要求两个水平得质控品需将这些质控品得信息设置在分析仪中包括每个质控品名称和批号、每个测定项目得靶值和标准差(二)特殊分析参数1、试剂吸光度及其变化得检查2、酶活性测定准确度得监测3、校准检查4、前带检查5、样品信息监测6、样品预稀释7、方法学补偿系数8、参考范围9、线性范围和可报告范围1、试剂吸光度及其变化得检查(1)试剂空白吸光度检查就是检查试剂质量得一个指标每种试剂本身有一定吸光度(AB)超出为其设定得范围时分析仪会报警,提示试剂变质如:ALP、GGT、AMY试剂,色素原底物可逐渐自身分解生成黄色产物,使其AB升高利用Trinder反应原理得试剂,其中酚类物质会逐渐氧化为醌类产物,使AB升高多种试剂中NADH可逐渐氧化为NAD+,其AB会随时间延长而下降有些试剂久置后变混浊而使AB升高(2)试剂空白速率监测在连续监测法中使用,设置在加入R1后待测物未反应得时间段某些试剂在检测温度下于检测过程得短时间内,可发生较为明显得自身分解等变化,使测定结果偏高或偏低如设置了此参数,便能在待测物反应得吸光度变化速率中减去试剂空白速率,从而消除或减少这类误差如色素原底物能自发分解产生黄色产物,使测定结果出现正误差试剂空白速率监测胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐有负干扰因其在肌酐得检测波长505nm有较高光吸收且胆红素在碱性可被氧化,在肌酐反应过程其光吸收呈下降趋势图:空白速率法消除胆红素对肌酐测定得干扰

弹性速率原理2、酶活性测定准确度得监测(1)线性检查(linearcheck)用于连续监测法设定一个非线性度对读数时间进行线性判断

通过将读数时间内得吸光度值进行线性回归,计算各点得方差,根据方差值得大小来判断该读数时间就是否处于线性期(2)弹性速率(flexrate)酶活性测定中,当酶活性太高,在读数时间内已不呈线性反应。有些仪器具弹性速率功能,能选择读数时间前段仍呈线性得吸光度值计算结果,使酶活性测定得线性范围得以扩大(3)底物消耗限值(substrateexhaustlimit)在连续监测法得测定项目中,可设置化学反应后吸光度升高(正反应)或下降(负反应)得限值超过此限值说明酶反应得底物消耗过多,已不足以维持底物得零级反应,该检测结果不准确3、校准检查(1)离散性检查在做校准包括试剂空白时,分析仪通常都重复两次并计算两次吸光度得差值,其差值可做设定(2)敏感度检查AS与AB之差应保持相对恒定,可设定范围(3)偏移检查非直线及多点校准标准曲线中,标准液各浓度在拟和曲线中得A与实测A之差为偏移值,可设定限值(4)校准系数检查本次校准K值与上次校准K值比较得检查4、前带检查典型抗原抗体反应得校准曲线呈S形,曲线下端,抗原(Ag)量很少,抗体过剩,免疫复合物生成很少,称为前带(prezone)(图中0-A段)

浊度随Ag增加,进入相对线性期(A-B)和平衡区(B-C)Ag继续增加时,因抗体不足导致沉淀增加,浊度反下降,

为抗原过剩区,称为后带(postzone)(C-D段),此时测定结果可显著偏低,这就是透射比浊法得缺陷前带检查大多数分析仪针对以上现象有前带检查功能,方式不甚一致反应速度比法:

将添加抗血清后得反应初速度对平均速度之比得出得前带检查值,与输入得前带界限值(％)进行比较

前带检查值＝×1005、样品信息监测样品溶血、脂浊、黄疸等会对测定结果产生干扰按光谱吸收特性,用双波长或多波长检测其性质和程度在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm测定样品吸光度比值得大小6、样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值便可在分析前自动对样品进行高倍稀释7、方法学补偿系数用于纠正不同分析方法间测定结果得不一致性有斜率和截距两个参数8、参考范围超过此范围得测定结果,仪器会打印出提示9、线性范围(linearityrange)和可报告范围样品结果若超过线性范围,分析仪将提示多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定重测能达到得准确范围为可报告范围(三)分析参数设置举例以肌酸激酶得某通用试剂盒在某分析仪上使用为例1、某生化分析仪有关参数得设置范围总反应容量180µl~350µ,样品量2µl~35µlR1量20µl~270µl,R2量20µl~270µl第二试剂可加入时间为1、5min和4、5min测光点间隔18s,总反应时间10min2、肌酸激酶试剂盒通用参数样品量50µl,R1

1000µl,37℃保温5min,加R2

500µl波长340nm,延迟时间2min,连续监测2minNADH得ε为6220

3、根据以上条件进行参数设置(1)按比例减少样品量和各试剂量使反应液总容量在分析仪180µl~350µl范围内

选择Vs10µl,R1量200µl,R2量100µl,则VT310µl

或者Vs8µl,R1量160µl,R2量80µl,则VT248µl(2)确定第二试剂加入时间根据通用参数,应选择第4、5min为R2加入点(3)确定读数时间由于R2在第4、5min加入,换算成监测周期为第16、17点之间

加上2min延时,则第24个测光点为第1读数点

选择24~31为读数时间

(4)计算理论K值根据样品量10µl,R1200µl,R2100µl,ε6、22,b为1,代入计算公式,则:

K=

=

=4984也可采用肌酸激酶校准品,执行校准程序来得到校准K值4、对新设置得反应参数进行试运行开始运行,分析仪对各反应参数得逻辑合法性进行检测,若有错误,则会显示错误信息并停机,需根据提示信息对反应参数进行修改返回章目录一、基本操作步骤(一)自动生化分析仪得工作过程(二)操作前检查和校准(三)质控品测定(四)病人标本得测定

二、主要得维护保养三、自动化分析与手工操作得比较第三节

自动生化分析仪得操作方法一、基本操作步骤(一)自动生化分析仪得工作过程自动生化分析仪在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定得程序进行工作1、取样、加试剂和混匀

样品盘转动使样品进入待测位置,样品针吸样到反应杯中反应盘旋转到一定位置;试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置,试剂针吸取试剂到反应杯反应盘旋转到一定位置,搅拌混匀2、保温反应和吸光度检测反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应当反应盘旋转至该反应杯通过吸光度检测窗口时,即被检测得到一个吸光度值;再按规定得间隔时间检测该反应杯得吸光度值直至总反应结束总反应时间一般为10min,如果18s为吸光度检测间隔时间,则10min得到34个测光点分析仪能显示或/和打印反应全过程得时间-吸光度曲线3、计算、显示或打印结果根据各测光点吸光度值对某一检测项目进行结果计算并显示或打印出每个标本得报告也可按测定项目显示或打印出全部标本得结果(二)操作前检查和校准

1、操作前检查

(1)纯水供给就是否正常或足量

各项分析试剂就是否充足

各种清洗剂就是否足够

(2)光度计检查确认光路与检测系统就是否正常

(可设定在自动开机得程序中)2、校准按分析项目得稳定性不同确定不同得校准频度如每日、每周、每月、每两月校准,甚至每六个月校准等以下情况必须进行校准:①改变试剂得种类或者批号若能说明改变试剂批号不影响测定结果,可不进行校准②分析仪进行一次大得预防性维护或者更换了重要部件③出现失控,采取一般措施后,不能识别和纠正问题(三)质控品测定每批样品测定均应该有质控样品同时监测批测定指一批样品从开始测定到完成测定后停止得整个过程

其中添加或更新试剂、进行过有可能改变吸光度得维护等操作,均应进行一次质控样品得检测实际工作中,通常在分析批得开始先进行质控品测定,如果室内质控符合要求即结果在控,则可进行病人标本得测定。失控:13S,22S,R4S,41S,10;12S为警告出现失控需查找原因并加以解决失控原因包括试剂、校准品、质控品、仪器因素,以及操作上得失误(四)病人标本得测定1、项目输入(1)手工输入①逐项输入:将每个标本得所有测定项目逐项地输入②组合(profile)项目输入:预先有组合项目设置时可输入③批量输入:针对有连续相同测定项目得标本(2)样品条码识别

分析仪自动阅读样品条码,识别样品信息和需测定项目

可杜绝样品错误和项目输入错误,并进一步减轻人力消耗2、样品测定

在开始测定画面,输入该批第一个标本得标本号,分析仪即会自动逐个地对标本进行测定具有条形码得样品不需输入起始标本号3、急诊检验几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”得功能仪器备有急诊样品分析位置或专用样品架及其专用编号在急诊样品位置上放置了样品,并输入急诊检验项目后,就会在常规样品得测定过程中优先对该样品进行分析测定二、主要得维护保养分析仪在操作过程中一般均能进行主要部件自动清洗为保证仪器正常运行,还需严格按操作手册做定期维护1、每天维护

①检查和清洗样品针、试剂针、搅拌棒②添加或更换试剂③添加清洗剂等2、每周维护

①比色杯清洗②比色杯空白吸光度检查③清洗恒温水槽3、每月维护清洗装置本身、纯水桶、供水过滤器、散热器过滤网等4、不定期维护对一些易磨损得消耗部件进行检查与更换:①进样注射器就是否漏水,各冲洗管路就是否畅通,各机械运转部分就是否工作正常②比色杯就是否需要更换③光源灯就是否需要更换三、自动化分析与手工操作得比较1、优点

①检测速度快②检测灵敏度高:A1、0~3、0甚至以上且可精确到0、0001

在符合郎白－比尔定律得前提下,线性上限提高③检测准确度高:能准确判断终点,能做连续监测法,各种自动监测判断功能④检测精密度高:取样和加试剂精度高,人为误差小,偶然误差少⑤样品和试剂用量少⑥其她:包括能精确地控制反应时间、精确地控制反应温度、能进行复杂得结果计算如非线性计算等2、缺点①无连续波长可选:选择合适得次波长有时很困难②操作时间受限