2012年第五、六章分子生物学研究方法

第五章分子生物学研究方法第一节、重组DNA技术发展史上的重大事件第二节、DNA基本操作技术第三节、基因克隆的主要载体系统第四节、基因的分离与鉴定基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。引言引言

跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。基因工程技术区别于其他技术的根本特征5·1

重组DNA技术史上的重大事件半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就:第一，解决了遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是DNA;第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。5·1重组DNA技术史上的重大事件他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EcoRl但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。5·1重组DNA技术史上的重大事件图D.5限制性核酸内切酶EcoRI识别回文序列并将其切割产生粘性末端。粘性末端具平末端DNA片段之间的连接图D.6由限制酶和连接酶产生的重组DNA分子。5·1重组DNA技术史上的重大事件5·1重组DNA技术史上的重大事件图D.9分子克隆的一般过程（质粒大小未按比例画）5·2DNA基本操作技术1、基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。5·2·1核酸的凝胶电泳在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。5·2DNA基本操作技术5·2·1核酸的凝胶电泳5·2DNA基本操作技术琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。2、琼脂糖凝胶电泳5·2DNA基本操作技术2、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。2、琼脂糖凝胶电泳5·2DNA基本操作技术在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。5·2DNA基本操作技术2、琼脂糖凝胶电泳5·2DNA基本操作技术图D.1DNA凝胶电泳。（a）DNA分子向正极迁移。较小的分子比大分子移动更快。（b）电泳后凝胶经过染色显示的DNA条带。5·2DNA基本操作技术2、琼脂糖凝胶电泳5.2.2核酸的分子杂交将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印"上去的，因此，核酸杂交也被称为"DNA印迹杂交"。由于该方法是E·M·Southern于1975年首先设计出来的，所以又叫做Southernblotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。5.2.2核酸的分子杂交一、Southernblotting核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）；第二，将滤膜与DNA或RNA探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80℃下烘烤1～2h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng；为了安全，我们用DIG（地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号。5.2.2核酸的分子杂交一、Southernblotting基因组DNA被限制性内切酶酶切为DNA片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（c）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的DNA条带原封不动地"吸印"到滤膜上去。（d）在80℃下烘烤1～2h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。(e)

滤膜放入带标记的DNA或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。5.2.2核酸的分子杂交一、Southernblotting一、Southernblotting5.2.2核酸的分子杂交5.2.2核酸的分子杂交Southernblotting图D.2Southern印迹法。探针与互补序列条带结合而让它能被看到。二、Northernblotting

1、Northern印迹杂交是检测特定基因是否转录和转录的强弱情况。它不但用于基因工程中检测目的基因的转录情况，而且也广泛用于功能基因调控的研究。具体方法是从细胞中提取mRNA，经电泳将不同大小的mRNA分子分开后，印迹转移于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与特定的探针DNA杂交后，洗去未杂交上的标记探针DNA。经放射自显影显带，根据带密度的强弱就可确定其表达的相对值。

1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern印迹杂交技术（Northernblotting）。二、Northernblotting2、Northern杂交原理

将变性的RNA或mRNA（用甲醛、乙二醇，防止RNA形成二级结构）用琼脂糖胶电泳分离，转移吸印到特殊（叠氮化的或其它化学修饰的）的活性滤膜或滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起，与标记的探针RNA或DNA杂交，然后放射自显影以分析RNA（大小、数量）的方法，这种方法同萨瑟恩的DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺塞恩RNA吸印杂交技术（Northernblotting）。二、Northernblotting三、Westernblotting

将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。

（一）、概念三、Westernblotting（二）、原理：蛋白质印迹(Westernblotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。三、Westernblotting（三）蛋白质印迹步骤：1、固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2、封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3、初级抗体(第一抗体)是特异性的。4、第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5、适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。三、Westernblotting（四）、蛋白质印迹实验流程三、Westernblotting特异抗体的制备（a）及其它们与不同蛋白质的特异性结合（b）。

三、WesternblottingWestern印迹法。标记的抗体与蛋白质特异条带结合而让它显示出来。免疫共沉淀法分离蛋白质细胞提取物直接与针对该蛋白的抗体混合。同时加入另一种与抗体结合的蛋白，它能使抗体发生聚集，那些与抗体结合的细胞提取物中的蛋白也会因此而聚集在一起。这种抗体与目标蛋白之间的聚集会产生沉淀。该沉淀可以用凝胶对目标蛋白进行鉴定。

免疫共沉淀过程图

免疫共沉淀DNA芯片

一种生物的几千个基因以独特的方式被体现在一块小的芯片上，每个基因占据一个点。每个点含有一种高浓度的寡聚物，它只与对应的基因互补。之后从处于一种条件下的细胞中提取mRNA。通过反转录将mRNA转变成DNA并带上红色标记。然后，从处于另一条件下的细胞中提取mRNA。将此mRNA转变成DNA并带上绿色标记。

DNA芯片

DNA芯片技术的原理

X射线晶体衍射

用X射线轰击得到的蛋白质晶体。由于X射线的波长与原子的大小差不多，因而会发生一种称为衍射的现象，衍射现象使X射线波分开。衍射的样式可以用计算机程序进行分析，从而在原子水平上给出非常清晰的蛋白质3-D排列图象。晶体结构是很难获得的，主要原因是每种蛋白质的结晶条件不一样并且很难确定。对那些膜蛋白和具有松弛、非结构化区域的蛋白质进行结晶尤其困难。X射线晶体衍射确定某种蛋白在细胞中位置的最有效方法是让该蛋白带上荧光标记或放射性标记。荧光蛋白暴露在一定波长的光下时能发射出不同波长的光，这种光能用特殊的显微镜在很高的放大倍数下进行检测。让蛋白质带上荧光标记最通行的方法是将它与一个小的荧光蛋白融合（图D.19）。常用的是绿色荧光蛋白（GFP）。可以应用基因工程的方法将任何基因与GFP基因进行组合。当这样的重组基因在细胞中表达的时候，该基因的蛋白质将与GFP融合在一起。一般情况下，GFP是挂在该蛋白的一个末尾上，不会明显地改变该蛋白的功能。蛋白质定位蛋白质位置的测定。（a）制备融合蛋白。（b）用GFP做标签使蛋白质的亚细胞位置可见。（来源：www.）蛋白质定位酵母双杂交

用来检查两种蛋白之间的结合。转录激活蛋白是模块化的蛋白，它们具有一个DNA结合结构域，又有一个分开的激活转录的功能域。在激活一个基因的转录时，这两个域都是需要的。在双杂交分析中，将一种供试蛋白与某种激活蛋白的DNA结合域融合。而将另一种供试蛋白与该激活蛋白的激活域融合。之后让两种蛋白都在具有一种报告基因的酵母细胞中表达。如果该报告基因受到激活蛋白的刺激，它能产生一种信号（一般是某种颜色）。两种融合蛋白中的任何一种都不能够激活转录。但是，如果这两种供试蛋白能够互相结合在一起，那么DNA结合域就能与转录激活域连接在一起。这样，这种重新组织起来的激活蛋白就能够启动报告基因的转录。

酵母双杂交

酵母双杂交2-DE技术蛋白质组学（proteomics）概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变化的一门科学。研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最终确定它们的功能。蛋白质双向电泳-2-DE技术蛋白质2维电泳1个方向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶主要是把蛋白质按照分子量分开1个方向是等点聚焦把蛋白质按照等电点的不同分开这样就可以把不同的蛋白质尽可能的分开可以结合质谱对细胞进行蛋白质组的研究例如我们研究癌细胞和癌旁细胞利用这个方法就可以知道两种细胞都有哪些蛋白质表达的不同。2-DE技术流程双向电泳(2DE/DIGE)目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析双向电泳示意图2-DE图谱DIGE图谱蛋白质双向电泳-2-DE技术5·2·3细菌转化

细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀(形成原生质球)，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而遗传。5·2·4核苷酸序列分析仪器分析发展很快。如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。下面介绍测序的基本原理。5·2·4核苷酸序列分析5·2·5基因扩增

聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。5·2·5基因扩增首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动("引导")新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。PCR技术的原理5·2·5基因扩增PCR反应的全过程

DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94℃)环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度(约56℃)制冷1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。PCR反应的全过程5·3基因克隆的主要载体系统细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质粒、RNA质粒报道）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

5·3·1质粒DNA及其分离纯化质粒用作基因克隆的载体分子，获得大量纯化的质粒DNA分子很重要。寄主细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤，加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促使大肠杆菌细胞裂解。细胞裂解反应需要相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，这样，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒DNA。5·3·1质粒DNA及其分离纯化5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法质粒DNA一般仅占细胞总DNA的l%～2%左右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别，所以，质粒DNA的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。方法：将含有EtBr的CsCl溶液加到大肠杆菌裂解液中，EtBr分子便会通过嵌入作用而结合到DNA链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色体DNA片段具有游离的末端而易于解旋，会结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的DNA分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制了EtBr分子的结合数量，染色体DNA片段比质粒DNA结合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体DNA片段具有更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法5·3·1·1氯化铅密度梯度离心法5·3·1·2碱变性法在pH值介于12.0～12.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，尽管在这样的条件下连接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理DNA混合物，质粒DNA能迅速而准确地复性，但随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。可以用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。这目前最流行的方法。5·3·2

重要的大肠杆菌质粒载体

5·3·2·1pSC101质粒载体pSC101是低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因(tetr)。该质粒具有EcoRI、HindⅢ、BamHI、SalI、XhoI、PvuⅡ以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单切割位点，在HindⅢ、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。pSClO1质粒具有可插人外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，还具有四环素抗性的强选择记号，便于筛选。因此，它第一个被选为真核基因的克隆载体。这个质粒载体有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSClOlDNA，其产量就要比其他质粒载体低得多。5·3·2·1pSC101质粒载体5·3·2·2pBR322质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号，又具有低分子质量、高拷贝以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。目前，在基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成的:含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四环素抗性基因(tetr)和DNA复制起点(ori)(图5-22)。

pBR322质粒载体较小,其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大（6-8kb）的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。5·3·2·2pBR322质粒载体pBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号，方便选择。如：将外源DNA克隆在BamHI位点上，将这样的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，并涂布在含氨卡青霉素的选择性培养基平板上，那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型，它们必定是获得了编码有这种抗性基因的转化子。第三个优点是具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。5·3·2·2pBR322质粒载体5·3·3λ噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，系指吞噬之意。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，这是因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。噬菌体有两种类型：1、溶菌周期（烈性噬菌体）：噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。2、溶源生长周期（温和噬菌体）：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。5·3·3λ噬菌体载体以噬菌体DNA分子作载体，克隆含有目的基因的外源DNA片段，只要不导致重要的噬菌体基因失活，这种重组的噬菌体DNA感染了寄主细胞之后，插入的外源DNA片段便会随着噬菌体DNA分子一道增殖。可按照类似于制备质粒DNA的方法，分离到大量的重组体噬菌体DNA，实现克隆基因的扩增。5·3·3λ噬菌体载体λ噬菌体的分子为48.5kb，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）;另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代之后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。5·3·3λ噬菌体载体

在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5‘单链突出序列（粘性末端）。当λ噬菌体的线性DNA分子注入到被感染寄主细胞内时，会通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5’-P和3'-OH基团封闭起来。这种粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点cohesive-endsite，粘性末端位点)。5·3·3λ噬菌体载体野生型的λ噬菌体DNA具有太多的常用限制性核酸内切酶切割位点（5个EcoRI酶切位点和7个HindⅢ酶切位点）。这使它不适于用作基因克隆的载体，想办法从野生型λ噬菌体基因组DNA上消去一些多余的酶切位点并切除非必要区段，将它改造成适用于基因克隆的载体。介绍改造后的两种类型：1·插入型载体外源DNA克隆到插入型λ载体分子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型。5·3·3λ噬菌体载体(1)免疫功能失活插入型载体：载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种限制性内切酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，阻碍其进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插人的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。5·3·3λ噬菌体载体(2)β-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码β-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。5·3·3λ噬菌体载体2·替换型载体又叫作取代型载体（substitutionvector)，是在λ噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段。当外源DNA插人此类载体时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因，这种λNM781噬菌体感染细胞后，其lacZ基因的突变琥珀被抑制，因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。但是，如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。2·替换型载体5·3·4柯斯质粒载体“Cosmid”一词是由英文“cossite-carringplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。柯斯质粒是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒载体pHC79质粒兼具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面的优点，其克隆能力为31～45kb，而且能够被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。5·3·4柯斯质粒载体第一，具有λ噬菌体的特性。在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，能按照λ噬菌体DNA同样的方式环化。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒DNA一样在寄主细胞内进行复制，并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。柯斯质粒载体的特点第三，具有抗菌素抗性基因，可供重组体分子选择。第四，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子较小，一般只有5～7kb左右。因此，可以插入到载体上并能被包装成λ噬菌体颗粒的最大外源DNA片段，克隆极限可达45kb左右。柯斯质粒载体的特点5·3·4柯斯质粒载体5·4基因的分离与鉴定生命科学各个研究，“克隆”（clone)被广泛使用。通常克隆是无性繁殖。在不同层面的含义：在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体；从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆。在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。基因克隆包含待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容，整个过程包括如下4个基本步骤:(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化;(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应;(3)将人工重组的DNA分子导人它们能够进行正常复制的寄主细胞;(4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。5·4基因的分离与鉴定5·4·lDNA片段的产生与分离从实验材料中制备包括“目的基因”在内的DNA片段群体，必须包容整个基因组的全部序列，DNA片段的大小要适合于基因操作的要求。鸟枪法(shot-gunapproach)：限制性内切酶消化供体基因组DNA，直接将消化产物与载体分子相连接。重组体分子带有大小不同的插入片段。真核基因组庞大，载体承受外源DNA插入为1000～3000bp，将产生几十万个大小不同的DNA片段，这些大小不同的DNA片段形成的重组体分子组成相应克隆群体。要想从如此巨大的群体中选出带有目的基因的克隆太费事。5·4·lDNA片段的产生与分离局部双酶消化法可以保证DNA产物大小在10～30kb左右，通过离心或制备凝胶电泳技术，得到约为20kb的随机群体并将其克隆到合适的载体上，克服鸟枪法的困难。5·4·lDNA片段的产生与分离5·4·2重组体DNA分子的构建1·外源DNA片段定向插入载体分子：载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对(NE1和NE2)切割，二者将按一种取向退火形成重组DNA分子，保证外源DNA片段定向插入载体分子。若载体分子和外源DNA插入片段不能产生出互补的粘性末端，则采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。

5·4·2重组体DNA分子的构建2·最佳连接反应经限制性内切酶切割后的线性载体分子的自身不允许再环化。采用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生的线性载体分子，除去该DNA的5’-P末端，而留下一个5’-OH基团。当插入了外源DNA片段，其5’为-P末端，从而能有效重组。在连接反应中，使用正确的载体DNA和外源DNA的比例，是获得高产重组转化子的重要因素。用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体DNA/供体DNA的连接反应体系有利于重组分子的形成。用质粒作为克隆载体，其重组体分子由一个载体分子和一个供体DNA片段连接环化而成，当载体DNA与供体DNA的比值为1时，有利于这类重组体分子的形成。2·最佳连接反应3·重组体分子导入受体细胞的途径将外源重组体分子导入受体细胞的主要途径包括转化(或转染)、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。在基因工程中有详细介绍。5·4·3cDNA基因克隆真核生物基因组DNA大，含有大量的重复序列和内含子，难以直接分离到目的基因。通过RT-PCR可以部分解决。高等生物一般具有3～5万种左右不同的基因，在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有15%左右的基因得以表达，产生出约5000～10000种不同的mRNA分子。