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文档简介

培训一各种引物设计基因定义基因组DNAcDNARNA提取1、家族基因。就是指具有相同功能得,不同基因。2、转录本。就是指一个基因有两个不同得转录结果。都来自于一个基因,由于选择性剪切导致得。基因扩增PCR体系:酶,缓冲液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F,R。Forward,ReF引物R引物流程1、模板准备,引物准备2、PCR扩增3、片段回收4、连接TA克隆5、转化大肠杆菌6、测序,确定序列7、提质粒,保存菌液(15%-30%甘油)序列寻找exocytosisCs3g16120参考基因组网站:甜橙(Citrussinensis)。柑橘菌根模式:枳壳(Poncirustrif、),做为砧木,使用范围最广,抗寒。苜蓿基因组:。NCBI:文献搜索:基因研究情况。1、枳壳中基因,做亚细胞定位克隆启动子(用DNA)ATG前2kb,基因序列(用RNA反转录得cDNA)。2、对应到苜蓿中基因,做RNAi功能验证,荧光定量PCR验证。(用cDNA克隆)引物设计原则1、长度:15—30bp,其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR得最适延伸温度会超过Taq酶得最佳作用温度(74度),从而降低产物得特异性。2、G十c含量:应在40%一60%之间,PCR扩增中得复性温度一般就是较低Tm值引物得Tm值减去5—10度。引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3、Tm53-603、碱基分布得随机性:应避免连续出现4个以上得单一碱基。尤其就是不应在其3’端出现超过3个得连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。4、引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。5、引物之间:两个引物之间不应有多于4个得互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端得互补重叠。6、上下游引物得互补性:一个引物得3‘末端序列不允许结合到另一个引物得任何位点上。7、3’末端:如果可能得话,每个引物得3‘末端碱基应为G或C。8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。示范。。。最普通得PCR引物设计。。。荧光定量PCR引物设计1、Tm60度。2、片段特异性。在基因组上,仅存在这一条片段,只能扩出这一条片段。选取3‘UTR区域。3、片段长度在60-100bp左右。酶切法构建载体大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点1、选择载体上得酶切位点。保证所需要得基因片段中不包含此酶切位点。2、添加酶切位点和保护碱基。都添加到引物得5’端。Topo克隆Gateway反应RNAi超表达载体RNAi引

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