琥珀酸脱氢酶

三峡大学医学院生物化学教研室实验四酶的竞争性抑制问题1：本次实验提取的是什么酶？问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化什么化学反应？琥珀酸脱氢生成延胡索酸:

琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸(fumarate)琥珀酸(succinate)问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。问题4：何为竞争性抑制？问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何选择该物质作为抑制剂？问题6：如何设计实验方案检测酶被抑制的程度？竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。Ki：EI的解离常数，抑制常数EI不能转变成产物草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。COOCOOOxalate

酶被抑制的程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。

可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的程度。Theeffectofacompetitiveinhibitorcanbeovercomewithhighconcentrationsofthesubstrate离心技术利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心机转子从静止状态加速旋转如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、浮力FB和摩擦阻力Ff。离心力转速（revolutionsperminute，rpm）相对离心力（relativecentrifugalforce,RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数，×g

RCF＝1.118×10-5RN2

R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分）低速离心常以rpm表示超速离心以×g表示。离心机转数与离心力的列线图转子半径相对离心力转速相对离心力的计算为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，制作了离心转子的半径、转速和相对离心力三者关系的列线计算图。离心机的分类目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多，按其离心转子所能达到的最高转速分为：低速离心机(在6,000rpm以下)高速离心机(在25,000rpm以下)超速离心机(在30,000rpm以上)目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm，相对离心力达803,000×g。

低速离心机台式高速冷冻离心机超速冷冻离心机离心机转子常用的离心机转子有三种：(1)固定角度转子(fixed-anglerotor)；(2)水平转子(swing-outrotor或swing-backetrotor)；(3)垂直转子(verticalrotor)。转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。离心操作注意事项1．精密平衡2．对称放置3．锁定盖子4．限速运转确认所用转子最大额定速度，离心机不能超过最大额定速度的75%。5．停转开盖6．选择合适的离心管和转子一般离心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替离心管。液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或被腐蚀。实验目的学习动物的处死方法学习动物组织匀浆法学习离心机的使用方法了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理解酶的竞争性抑制原理酶竞争性抑制实验所需试剂1、pH7.4磷酸缓冲液2、0.25％琥珀酸钠溶液3、0.5％草酸钠溶液4、0.01％甲烯兰溶液小鼠的抓取保定

小鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如图11-3所示）放在格板或铁笼上。趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌（如图11-4所示）；放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠（如图11-5所示），完成抓取保定。颈椎脱臼处死法处死小鼠

将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。注意:

实验人员的安全；确认实验动物已经死亡；妥善处理好尸体。肝脏组织匀浆法匀浆的方式手工匀浆机器匀浆：组织捣碎匀浆器超声匀浆：超声粉碎机反复冻融实验步骤1、肝糜液的制备：取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏全部取出（为何选肝脏？），置于研钵中，用生理盐水洗净肝脏中血液。用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。

（分几次加入，每次加入后均需充分研磨。）注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜上）。研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。试

剂1号管2号管3号管4号管5号管0.25％琥珀酸钠液0.50—0.502.000.500.5％草酸钠液—0.500.500.502.00蒸馏水2.002.001.50——肝糜液1.001.001.001.001.00甲烯蓝5滴5滴5滴5滴5滴2、另取中试管五支，标号，按下表操作(单位为ml)：摇匀(