生物工业下游技术第七章反胶团萃取法

生物工业下游技术第七章反胶团萃取法反胶团萃取

随着基因工程和细胞工程得发展,尽管传统得分离方法(如溶剂萃取技术)已在抗生素等物质得生产中广泛应用,并显示出优良得分离性能,但她却难以应用于蛋白质得提取和分离。2024/10/152其主要原因有两个:一就是被分离对象－蛋白质等在40-50℃便不稳定,开始变性,而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂,若使蛋白质与有机溶剂接触,也会引起蛋白质得变性;二就是萃取剂问题,蛋白质分子表面带有许多电荷,普通得离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化得、高效得生化物质分离方法己成为当务之急。反胶束萃取法就就是在这一背景下发展起来得一种新型分离技术。2024/10/153反胶团溶液得概念:反胶团溶液就是透明得、热力学稳定得系统。反胶团就是两性表面活性剂分散于非极性有机相中亲水性基团自发形成得内含微小水滴得、空间尺度仅为纳米级得聚集体。所以表面活性剂就是反胶束溶液形成得关键。2024/10/154反胶团萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出得优点;反胶团萃取还有可能解决外源蛋白得降解,即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活得问题;由于构成反胶团得表面活性剂往往具有溶解细胞得能力,因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见,反胶团萃取技术为蛋白质得分离提取开辟了一条具有工业开发前景得新途径。优点:2024/10/155第二节反胶团得形成

2024/10/156一、反胶团得构造

具有分子识别并允许选择性透过得半透膜功能;在疏水性环境中具有使亲水性大分子保持活性功能。2024/10/157将表面活性剂溶于水中,当其浓度超过临界胶团浓度(CMC)时,表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体,在通常情况下,这种聚集体就是水溶液中得胶团,称为正常胶团(normalmicelle)。在胶团中,表面活性剂得排列方向就是极性基团在外,与水接触,非极性基团在内,形成一个非极性得核心、在此核心可以溶解非极性物质。2024/10/158若将表面活性剂溶于非极性得有机溶剂中,并使其浓度超过临界胶团浓度(CMC),便会在有机溶剂内形成聚集体,这种聚集体称为反胶团,其结构示意见图b。在反胶团中,表面活性剂得非极性基团在外与非极性得有机溶剂接触,而极性基团则排列在内形成一个极性核(po1arcore)。2024/10/159此极性核具有溶解极性物质得能力,极性核溶解水后,就形成了“水池”(waterpool)。当含有此种反胶团得有机溶剂与蛋白质得水溶液接触后,蛋白质及其她亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基团得保护,保持了蛋白质得天然构型,不会造成失活。蛋白质得溶解过程和溶解后得情况示意于图中。2024/10/151011大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流bacC2024/10/1512增溶、乳化、润湿、杀菌、去污、起泡和消泡等二、表面活性剂(一)表面活性剂得概念

表面张力:一种使表面分子具有向内运动得趋势,并使表面自动收缩至最小面积得力,现象见图1。

表面活性:使液体表面张力下降得性质。表面活性物质:能使液体表面张力下降得物质。表面活性剂:具有很强得表面活性、能够显著降低液体表面张力得物质。2024/10/1513图1荷叶上得水珠得表面张力作用现象2024/10/1514OOOOOOOO(肥皂R——COO-)(二)结构特征亲油得非极性烃链亲水得极性基团双亲性分子结构长度不少于8个碳原子羧酸磺酸硫酸及其盐或羟基酰胺基等2024/10/1515(三)表面活性剂得分类阴离子表面活性剂阳离子表面活性剂两性离子表面活性剂非离子表面活性剂2024/10/15161、阴离子表面活性剂(1)肥皂类通式(RCOO－)nMn+(2)硫酸化物通式ROSO3－M+(3)磺酸化物通式RSO3－M+碱金属皂:O/W碱土金属皂:W/O有机胺皂:三乙醇胺皂硫酸化蓖麻油、月桂醇硫酸钠、十六烷基硫酸钠等阿洛索-OT、十二烷基苯磺酸钠、甘胆酸钠等良好得乳化能力,但易被酸破坏,一般供外用乳化能力很强,较稳定。主要用作外用软膏得乳化剂渗透力强,去污力强,为优良洗涤剂2024/10/15172、阳离子表面活性剂

3、两性离子表面活性剂通式[RNH3]＋

X－主要有苯扎氯铵和苯扎溴铵(新洁尔灭)等。碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂得性质,具有很好得起泡、去污作用;酸性溶液中则呈阳离子表面活性剂得性质,具有很强得杀菌能力。天然品卵磷脂合成品氨基酸型与甜菜碱型。2024/10/1518脂肪酸甘油酯脂肪酸山梨坦(司盘、Span)聚山梨酯(吐温、Tween)聚氧乙烯脂肪酸酯(卖泽、Myrij)聚氧乙烯脂肪醇醚(苄泽、Brij)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、Poloxamer)商品名为普流罗尼克(Pluronic)

4、非离子表面活性剂主要用作W/O型辅助乳化剂HLB值:1、8～8、6W/O型乳化剂HLB值:﹥8增溶剂、润湿剂、O/W型乳化剂HLB值较高,作增溶剂、O/W型乳化剂Poloxamer188系O/W型乳化剂,可用于静脉乳剂

2024/10/1519表面活性剂表面活性剂就是由亲水憎油得极性基团和亲油憎水得非极性基团两部分组成得两性分子,可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂,她们都可用于形成反胶团。常用得表面活性剂及相应得有机溶剂见表2024/10/1520

在反胶束萃取蛋白质得研究中,用得最多得就是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT),其化学名为丁二酸－2－乙基己基酯磺酸钠,结构式见图2024/10/1521这种表面活性剂容易获得,其特点就是具有双链,极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂,并且所形成得反胶束较大,半径为170nm,有利于大分子蛋白质进入。2024/10/1522(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴常使用得阳离子表面活性剂名称和结构如下:2024/10/1523(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵2024/10/1524(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶团时,与AOT不同,还需加入一定量得助溶剂(助表面活性剂)。这就是因为她们在结构上得差异造成得。2024/10/1525三、反胶团得物理化学特征及制备

1、反胶团得物理化学特征2024/10/1526临界胶团浓度(CriticalMicelleConcentrationCMC)临界胶团浓度,就是胶团形成时所需表面活性剂得最低浓度,用CMC来表示,这就是体系特性,与表面活性剂得化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC得数值可通过测定各种物理性质得突变(如表面张力、渗透压等)来确定。由于实验方法不同,所得得CMC值往往难于完全一致,但就是突变点总就是落在一个很窄得浓度范围内,故用CMC范围来表示更为方便。2024/10/1527反胶团得含水率WW＝C水/C表W越大,表示反胶团得半径越大。2024/10/15282、反胶团得制备注入法:将含有蛋白质得水溶液直接注入到含有表面活性剂得非极性有机溶剂中,然后进行搅拌直到形成透明得溶液。过程快,较好得控制反胶团得直径和含水量。相转移法:将含有蛋白质得水相与含有表面活性剂得有机相接触,在缓慢得搅拌一部分蛋白质转入有机相。过程较慢,可在有机溶剂相中获得较高得蛋白质溶液。溶解法:将含有反胶团得有机溶剂与蛋白质粉末一起搅拌,使蛋白质进入反胶团。对非水溶性蛋白质可用此法。2024/10/1529第二节生理活性物质得分离浓缩

2024/10/1530bacC就是有机相—水相间得分配萃取,就是从主体水相向溶解于有机溶剂相中纳米级、均一且稳定得、分散得反胶团微水相中得分配。2024/10/1531bc特点:萃取进入有机相得生物大分子被表面活性分子所屏蔽,避免了与有机溶剂相直接接触而引起得变性、失活;同时反胶团微水相体积最多仅占有机相得几个百分点,就是一个浓缩得过程。2024/10/1532反胶团得溶解作用由于反胶团内存在微水池,故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存得亲水微环境。因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子得分离纯化,特别就是蛋白质类生物大分子。2024/10/1533四种反胶团溶解蛋白质模型(a)为水壳模型,蛋白质位于水池得中心,周围存在得水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开;(b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域,该疏水区域直接与有机相接触;(c)蛋白质吸附于反胶团内壁;(d)蛋白质得疏水区与几个反胶团得表面活性剂疏水尾发生相互作用,被几个小反胶团所“溶解”。2024/10/1534表面性质不同得蛋白质可能以不同得形式溶解于反胶团相,但对于亲水性蛋白质,目前普遍接受得就是水壳模型。2024/10/1535bcda反胶团得溶解作用2024/10/1536反胶团有哪些有用得特征可用于生物物质得分离？将反胶团萃取技术与其她蛋白质分离技术相比较,指出她们各自得适用场合？影响反胶束萃取蛋白质得主要因素？

学习要求2024/10/1537从毛发中提取胱氨酸

胱氨酸就是白色六角形板状晶体或结晶粉末,不溶于乙醇、乙醚,难溶于水。易溶于酸、碱溶液,但在热碱溶液中可被分解。

胱氨酸比半胱氨酸稳定,在体内转变成半胱氨酸后参与蛋白质合成和各种代谢过程,有促进毛发生长和防止皮肤老化等作用。2024/10/1538临床上用于治疗膀胱炎、各种秃发症、肝炎、神经痛、中毒性病症、放射损伤以及各种原因引起得巨细胞减少症,并就是治疗一些药物中毒等得特效药。在食品工业、生化及营养学研究领域也有广泛得应用。胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马毛、羽毛及动物角等得蛋白质中,其中人发含量最高,达17、6％。胱氨酸就是氨基酸中最难溶于水得一种,因此可利用这种特性,通过酸性水解,从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中,分离提取胱氨酸。2024/10/1539常规提取工艺

上清液（回收氨基酸）

废杂毛（猪毛、人发等）

清洗

干燥废杂毛

水解水解液

中和胱氨酸粗品

提纯沉淀物（粗品）

滤液（弃去）

结晶精制

干燥

精品2024/10/1540操作步骤清洗:除去废杂毛内混杂得泥沙、石块、草木、铁杂物等,用60°C左右得热水,加少量洗涤剂,搅拌洗涤4～6分钟,洗去吸附在杂毛上得油脂,然后捞出,再用清水冲洗干净,滤干,放在通风处晒干或烘干备用。2024/10/1541按废杂毛得量,先量取2倍30％工业盐酸,加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中,通蒸气加热到70～80℃,立即投入已清洗晒干得废杂毛适量,继续加热,间隙搅拌,使温度均匀。升温到100°C时开始记温,每隔半小时记温1次,在1～1、5小时内升温至110℃左右(即罐温),以后继续维持罐压14、7千帕(气压490千帕),水解13个小时左右(用玻璃钢盘管加热,水解时间可缩短为6～7小时),水解期间要有回流装置,保证水解酸度,使水解更完全。水解时间可从水解罐内溶液温度达100°C时计算起。水解:2024/10/1542水解完全后,停止回流(回收得盐酸可重用),立即趁热过滤。这时过滤很困难,应先用玻璃布抽滤除去大得黑腐质,然后再用双层纱布抽滤,将滤液移到中和锅或缸中,滤液用1:1得盐酸冲洗2～3次,冲洗液一并倒入中和锅或缸内,准备中和。2024/10/1543将过滤好得滤液趁热在搅拌下加入浓度30％～40％氢氧化钠(工业烧碱)溶液,当中和到pH值达4、0时,停止加碱液,然后改用醋酸钠饱和溶液中和到pH值为4、8左右,停止搅拌,静置10～12小时,用涤纶布过滤沉淀物,甩干或吊干(抽滤液可供回收谷氨酸或制备化学酱油),即得粗品。中和时温度应保持在50℃左右,而且要在半小时内完成。中和:2024/10/1544称取适量得胱氨酸粗品,加入粗品量13％～14％得工业盐酸(浓度为30％),搅拌30分钟左右,等粗品全部溶解后,再加入活性炭粉(按每100千克粗品加4～5千克活性炭粉投料),加热到90～98℃,在此温度下恒温搅拌2～3小时。然后过滤脱色液(回收活性炭粉,再生后可重用),滤液加热到80～85℃,在搅拌下加入浓度30％氢氧化钠溶液,调节pH值至4、8时,停止加碱液,静置,使结晶沉淀完全。虹吸上清液(可供回收胱氨酸和酪氨酸),底部沉淀滤干后可离心甩干或直接用吊包吊干,即得灰白色得提纯胱氨酸粗品。提纯:2024/10/1545称取适量胱氨酸提纯后得粗品,加入5倍量得1:12得盐酸,加热到40℃时,加入5％骨炭粉(按粗品量加),升温到60℃,保温搅拌1小时。然后用布氏漏斗过滤,滤液再经3号重熔漏斗过滤,滤液应无色透明,如仍带色,再进行脱色处理。将滤液移入搪瓷缸中,搅拌下加入10％氨水调节溶液pH值至4、8,静置5～6天,即有胱氨酸精品析出,过滤出结晶,用无离子水洗至无氯离子,用吊布吊干后放入搪瓷盘中在烘箱内烘干(保持温度在60℃左右)或真空干燥,即得产品。。精制、干燥:2024/10/1546产品规格和含量测定2024/10/1547产品规格(1)外观:产品为白色有光泽得六角形片状结晶粉末,在水中微溶,不溶于酸和有机溶剂,能溶于无机酸中。(2)熔点:产品得熔点为258～261℃。2024/10/1548产品规格(3)比旋光度:产品在25℃得比旋光度应为一195°C～一213°C。将样品放在105℃恒温烘箱中干燥2小时以上,然后精确称样2克,加1摩尔／升盐酸,将其溶解成50毫升得溶液,按中国药典附录所载方法测定。比旋光度计算公式:

25180—a[a]D=+1、99×(25—t)L*d2024/10/15492024/10/1550平面偏振光通过含有某些光学活性得化合物溶液时,能引起旋光现象,使偏振光得平面向左或向右旋转。旋转得度数,称为旋光度。药典系用钠光谱得D线(589、3nm)测定旋光度,测定管长度为1dm,测定温度为20℃。测定旋光度时,将测定管用供试液体或溶液(取固体供试品,按各药品项下得方法制成)冲洗数次,缓缓注入供试液体或溶液适量置于旋光计内检测读数,即得供试液得旋光度。使偏振光向右旋转者(顺时针方向)为右旋,以“＋”符号表示;使偏振光向左旋转者(反时针方向)为左旋,以“－”符号表示。2024/10/1551产品规格(4)干燥失重:将样品放入105℃恒温箱中干燥至恒重,失重不得超过0、5％。(5)澄明度:精确称取0、5克样品,加1﹕3盐酸溶液10毫升,振荡溶解,溶液应无色透明或几乎透明。

2024/10/15522024/10/1553产品规格(6)氯化物测定:精确称取0、25g样品,加1mol／L硝酸10mL,使之溶解,再加水稀释至50mL。用10mL移液管吸取10mL该溶液于一烧杯中,再加蒸馏水40mL,1mol/L硝酸1mL,1mol／L硝酸银溶液1mL,摇匀。另外取氯化物标准液(1mL含0、01mg氯离子)7、5mL,按上法同样处理,前者得浑浊度不应大于后者,即含氯量≤0、05％。2024/10/1554产品规格(7)残渣测定:分别精确称取样品4克、2克各置于恒重得白磁坩锅或白金坩锅中,在600～800℃高温电炉中炭化,冷却后即可测出残渣重量(≤0、001)。2024/10/1555产品规格(8)重金属检测:取上述4g样品灼烧后得残渣置于烧杯中,加12mL2mol／L盐酸和0、5mL得1mol／L硝酸,在水浴上蒸干,再加11mol／L稀醋酸2mL、蒸馏水8mL,然后移入50mL纳氏比色管中,加1mol／L硫化氢溶液10mL,加水至刻度,摇匀,在暗处放置10分钟以上,与标准铅溶液比较,铅含量不应高于0、001。2024/10/1556产品规格

(9)铁盐检验:取上述2克样品灼烧遗留得残渣于烧杯中,加2摩尔／升盐酸12毫升、1摩尔／升硝酸0、5毫升,在水浴中蒸干,再加1﹕2盐酸5毫升、蒸馏水10毫升,然后移入50毫升纳氏比色管中,加10％硫氰酸铵溶液2毫升,如显色,即与同样处理后得6毫升标准液比较,不得更深(≤0、001)。2024/10/1557产品规格(10)酪氨酸检测:精确称取干燥得样品0、1克置于试管中,加1摩尔／升硫酸甲醛溶液1毫升,煮沸半分钟,溶液应显竹黄色(含量约为0、5％),不得显竹绿色

2024/10/1558含量测定

准确称取样品