医学教材单细胞基因组测序在胰腺癌诊治中的应用研究-梁廷波

汇报人：梁廷波申报单位：浙江大学

单细胞基因组测序在胰腺癌诊治中的应用研究汇报内容一、课题目标二、研究内容与技术路线三、课题任务的支撑条件四、经费预算汇报内容一、课题目标二、研究内容与技术路线三、课题任务的支撑条件四、经费预算研究目标完善胰腺癌患者CTC和CSC单细胞捕获平台，优化单细胞的DNA/RNA提取、扩增、和测序分析技术利用CTC单细胞测序寻找具有早期诊断价值的生物标志物利用CSC和CTC单细胞测序寻找胰腺癌复发及转移相关基因，预测预后并实现有效干预肿瘤进展利用CTC单细胞测序对化疗疗效进行评估，寻找耐药相关基因，探索个体化治疗根据CTC单细胞测序结果，建立外周血检测胰腺癌基因变异的循环肿瘤DNA（CirculatingtumorDNA,ctDNA）的方法汇报内容一、课题目标二、研究内容与技术路线三、课题任务的支撑条件四、经费预算研究内容（1）单细胞操纵平台的建立CTC、CSC捕获、分离及技术优化单细胞DNA/RNA微量扩增、测序技术优化单细胞克隆演化信息分析ctDNA的检测技术开发研究内容（2）早期诊断复发转移药物治疗挖掘早期诊断新的生物标记物发现复发转移相关基因研究化疗耐药机制寻找药物治疗靶点单细胞操纵平台胰腺癌个体化综合诊治技术路线（1）单细胞分离捕获DNA/RNA提取、MDA方法微量扩增文库构建DNA测序/RNA测序数据整合分析单细胞测序变异ctDNA检测原发/转移瘤组织外周血LCM/液态挑取(CSC-CD133与CD44+cMet)CellSearch微流控芯片SET-iFISHLCM/液态挑取技术路线（2）外周血CTC正常人10例胰腺癌10例挖掘早期诊断新的生物标记物癌前病变10例潜在的分子标记物LiquidBiopsy正常人/癌前病变/胰腺癌各50例临床验证技术路线（3）发现复发相关基因

胰腺癌根治性切除术20例术中门脉血/外周血各10mLCTC

术后每三月随访一次获取外周血CTC无复发局部复发远处复发

三年外周血CTC复发肿瘤组织原发瘤组织CSC技术路线（4）发现转移相关基因局部晚期胰腺癌10例转移胰腺癌10例可切除胰腺癌10例原发瘤CSC原发瘤CSC转移瘤vs.vs.单细胞克隆演化信息分析技术路线（5）不可切除胰腺癌20例可切除胰腺癌20例辅助化疗DFS评价一线化疗PFS、OS评价50例患者进行验证50例患者进行验证研究化疗耐药机制寻找药物治疗靶点胰腺癌CTC鉴定捕获技术总结前期研究基于表面标记物（EpCAM）的分离方法：-Cellsearch（在胰腺癌CTC捕获中效率低，可能由于EpCAM等上皮标记物在CTC中多表达缺失）基于细胞大小差异的分离方法：-ISET(Isolationbysizeofepithelialtumorcells)，问题在于获取的膜上的细胞不易被分离下来阴性富集（去除RBC、WBC）+免疫荧光染色-Inertialfocusingdevice,SET-iFISHCD45DAPIPan-CKFISH-CEP8SET-iFISH鉴定胰腺癌CTC:DAPI+CD45-CK+/-FISH+上皮标记物（CK、EpCAM等）常缺失前期研究鉴定获得的胰腺癌CTC最终经LCM或液态口吸法挑取最终得到单细胞微流控注射泵后期被黏附细胞的收集二维芯片（CTCs富集）前期研究基于电活性薄膜的CTC捕获芯片微电压响应的界面材料和EpCAM抗体黏附分子的二维CTCs细胞捕获芯片BenWang;ACSAppliedMaterials&Interface;underrevision.胰腺癌CTC1.25V具体任务指标发现2-3个与胰腺癌转移、复发密切相关的基因；发现1-2个具有高度敏感性和特异性的基因水平诊断标记物；发现2-3个预后判断和化疗耐药的标记物；撰写高质量SCI学术论文5～8篇，其中相关权威期刊3～5篇，影响因子大于10分以上1～2篇。参加国际会议交流、发言2～3次；申请国内外技术发明专利2～3项；争取获得全国百篇优秀博士毕业论文1篇；培养硕士研究生2～3名，博士研究生1～2名；汇报内容一、课题目标二、研究内容与技术路线三、课题任务的支撑条件四、经费预算研发团队胰腺癌治疗历史悠久，全国首例胰腺癌根治性切除手术；国家科技进步二等奖；

现为浙江省“胰腺癌综合诊治创新团队”；每年诊治胰腺癌500余例，手术技术达国际先进水平；

与国外最著名的几大胰腺癌中心建立了广泛的合作；

拥有完善的胰腺癌生物样本库。浙江大学附属第二医院—牵头单位

复旦大学中山医院、北京大学一院均为国内大规模胰腺癌诊治中心之一；

每年诊治胰腺癌患者合计1000例以上，根治性切除500例以上；合作单位负责人杨尹默、楼文晖教授均为国内胰腺外科著名专家；

深圳大学附属一院在肿瘤单细胞捕获技术以及基因测序上经验丰富；

华大科技在基因高通量测序技术上国际领先；

约翰霍普金斯医院在胰腺癌诊治上世界第一，在ctDNA方面全球领先。研发团队合作单位工作基础

在临床方面，引领胰腺癌的综合治疗；

在基础研究方面，在肿瘤的微环境、新生血管形成、免疫逃逸、耐药机制、信号通路等取得了较多研究成果；

完成了相关多项国家自然科学基金项目；Oncogene,2014,onlineMolCancerTher,2014,13,2062.Gastroenterology,2013,144,1230.AnnSurgOncol,2013,20,S725.AmJHumGenet,2013,93,249.Carcinogenesis,

2013,34,962.ClinCancerRes,2012,18,6339.Pancreatology,2012,12,183.AnnSurg,2012,255,326.SciTranslMed,2011,3,92ra66.AJG,2011,106,1521.CACancerJClin,2013,63,318.(影响因子153.459)CancerRes,2012,72,1363.(影响因子8.650)工作基础

华大基因研究院在单细胞测序技术处于国际领先水平Cell,2012,148,873.Cell,2012,148,886.约翰霍普金斯医院具备国际上独一无二的ctDNA研究实力NatMed,2008,14,985.SciTranslMed,2014,19,224ra24.梁廷波，教授，主任医师，博导

教育部长江学者特聘教授

国家杰出青年基金获得者卫生部有突出贡献中青年专家美国外科医师学会会员（FACS），国际肝胆胰协会会员

中华外科学分会胰腺学组委员，中国抗癌协会胰腺癌专业委员会委员

浙江省胰腺癌综合诊治创新团队负责人

浙江大学附属第二医院肝胆胰外科主任曾获国家科技进步二等奖1项、省部级科技进步一等奖4项以第一/通讯作者发表SCI论文40余篇项目负责人汇报内容一、课题目标二、研究内容与技术路线三、课题任务的支撑条件四、经费预算经费预算序号预算科目名称专项经费(万元)（一）直接费用4711设备费02材料费116.003测试化验加工费259.54燃料动力费05差旅费11.006会议费11.007国际合作与交流费21.008出版/文献/信息传播/知识产权事务费8.009劳务费44.5.0010专家咨询费0（二）间接费用29.00合计500.00任务分工及经费分配浙医二院350万复旦中山医院50万北大一院50万华大科技10万协调课题整体实施；构建单细胞捕获平台，提供80例胰腺癌样本，与华大科技合作完成单细胞测序和分析，以及ctDNA检测和分析20例胰腺癌样本获取、保存，基于CTC的胰腺癌早期诊断研究优化CTC、CSC单细胞捕获平台深大一院40万20例胰腺癌样本获取、保存，基于CTC的胰腺癌耐药相关基因研究单细DNA/RNA测序及数据分析前期预实验课题年度计划2015年利用Cellsearch与SET-iFISH捕获胰腺癌CTC并进行比较；建立并优化液态挑取和LCM进行单细胞捕获；优化微流控芯片系统分离单细胞技术；分离CSC单细胞；DNA/RNA微量扩增，鉴定单细胞分离效果。 2016年对CTC、CSC单细胞进行基因组、转录组测序，优化生物信息学分析；基于此寻找胰腺癌转移相关基因、寻找具有早期诊断价