微生物学试验教程

微生物学试验教程

《微生物学实验》是配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》一书的实验教材。第二

版做了较大修改，增添了许多新技术与方法，实验由原先的40个增至63个，并按类规纳成

15个部分。每一部分冠以综合性说明，简单介绍该部分内容及其在微生物学工作中的作用。

第二版仍着重微生物学实验的基本操作与技能训练。为方便教学，每一实验基本上仍按

照目的要求、基本原理、器材、操作步骤及实验报告(包含实验结果与思考题)五部分。书

后附有染色液、培养基、试剂与溶液的配制方法、本书使用的菌种名称，微生物学中常用的

计量单位及要紧参考书目。

第二版实验内容较多，各校可根据具体条件酌情选做。

第一版前言

《微生物学实验》一书是根据1977年10月成都综合性大学生物类教材会议制定的大纲

编写的。在编写过程中，为配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》教材，在内容上有所

增加与修改。

本书共有实验40个，内容较多，其中包含与《微生物学》相配合、印证理论与进行微

生物实验所需的基本操作与技能的训练两大部分。各校可根据具体条件酌情选做。

本书为方便教学，每一实验基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步骤及结果与

思考题等五个部分来编写的，各实验所用染料、培养基、溶液与悬液等的配制均列在附录内。

由于编者水平所限，在取材、实验方法与编排等方面确信有很多缺点与错误，希望读者

批判指正。

在编写过程中承武汉大学生物系微生物教研室基础微生物学教学小组的大力支持，武汉

大学生物系陈宝联同志绘制插图，在此一并表示感谢。

范秀容沈萍

第二版前言

《微生物学实验》第一版自1980年出版以来已有七八年了，在此期间，通过多次印刷,

印数已达十余万册。它在微生物学的教学与稳固教学秩序方面起了积极的作用，但是也存在

很多缺点，加上近年来微生物学技术进展迅速，因此我们进行了出版第二版的修订工作。

修订内容与特点如下：

1.将繁多的实验按类归纳成15个部分，以求条理清晰，概念分明。每一部分冠以综合

性说明，要紧简单介绍该部分的内容，阐述其在整个微生物学工作中的作用等。再在每一部

分选择有代表性的重点，列出实验，进行操作。

2.继续着重微生物学实验的基本操作与技能的训练。

3.实验内容做如下调整：

(1)为了加强学生对微生物及其应用与无菌概念重要性的认识，与对实验工具的质量要

求与洗涤方法的熟悉，增加了“微生物学实验室常用的器皿”、“环境中的微生物”与“食

品微生物学”等部分。

(2)使一些领域的内容更加全面，比如在“显微镜的结构、性能与使用方法”部分增加

了相差显微镜与电子显微镜；“微生物的纯培养”部分增加了厌氧培养；微生物的遗传方面

增加了药物抗性菌的分离与细菌的接合作用等实验。

(3)适当增加新技术的介绍，比如生化反应中的微量简易诊检系统；菌种保藏中的液氮

冷冻保藏法；水的微生物学检查中增加了滤膜法等。

(4)此外，在基本操作训练方面集中介绍了动物的几种不一致途径的注射方法。

(5)由于“环境中的微生物”包含了空气中微生物的检查，故没有再单独设实验，此外

还删去了“巴斯德效应”实验。

第二版的实验内容较多，有些内容由于实验条件与学时的限制，可作为学生日后进一步

工作的参考。因此各校可根据具体条件酌情选做。

4.第二版将实验报告分为实验结果与思考题两部分。实验结果尽量使用绘图与表格形

式，并要求在表格内用简单符号与数字填写，以使作业规范化，便于学生记录与教师批改。

5.增加了部分插图。

第二版要紧由范秀容、李广武、沈萍同志编写，彭珍荣同志参加编写了部分实验。

插图除沿用第一版由陈宝联同志绘制的以外，其余大部分插图由熊定荣同志绘制，个别

插图由刘启融同志绘制，在此一并致谢。

由于编者的水平有限，本版的缺点与错误在所难免，尚请各位同仁与读者提出宝贵意见。

编者

1988.6.

实验须知

普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；熟悉微生物

学的基本知识；加深懂得课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、

思考、分析问题与解决问题的能力；实事求是、严肃认确实科学态度与勤俭节约、爱护公物

的良好作风。

为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：

1.每次实验前务必对实验内容进行充分预习，以熟悉实验的目的、原理与方法，做到

心中有数，思路清晰。

2.认真及时做好实验记录，关于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下

每次观察的现象与结果，以便分析。

3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话与随便走动，保持室内安静。

4.实验时小心认真，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或者瓶不慎

打破、皮肤破伤或者菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切

勿隐瞒。

5.实验过程中，切勿使酒精、乙醛、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉

火源，再用湿布或者沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。

6.使用显微镜或者其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料与药品等

要力求节约，用毕后仍放回原处。

7.每次实验完毕后，务必把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有

菌液污染桌面或者其他地方时，可用3%来苏尔液或者5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去,

如系芽抱杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸

泡在3%来苏尔液中进行消毒。

8.每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点

进行培养。实验室中的菌种与物品等，未经教师许可，不得携出室外。

9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连

同思考题及时汇交教师批阅。

10.离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。

I、微生物学实验室常用的器皿

微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌与用来培养微生物，因此对其

质量、洗涤与包装方法均有一定的要求。通常，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高

温与短暂烧灼而不致破旧；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器

皿的形状与包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。

本节将对这几方面作全面介绍。

一、器皿的种类、要求与应用

1.试管（testtube）

微生物学实验室所用玻璃试管,其管壁务必比化学实验室用的厚些,这样在塞棉花塞时,

管口才不可能破旧。试管的形状要求没有翻口（图IT,A）,不然，微生物容易从棉塞与

管口的缝隙间进入试管（图IT,B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或者塑

料制的试管帽（图IT,C）,若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸

发试管内的水分，则需使用螺口试管（图IT,D）,盖以螺口胶木或者塑料帽。

试管的大小可根据用途的不一致，准备下列三种型号。

(1)大试管(约18X180mni)可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用(需

要大量菌体时用)。

(2)中试管(约13—15X100—150mm)盛液体培养基或者做琼脂斜面用，亦可用于病

毒等的稀释与血清学试验。

(3)小试管(10—12X100mm)通常用于糖发酵试验或者血清学试验，与其他需要节约

材料的试验

2.德汉氏试管(Durhamtube)

观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，通常在小试管内再套一倒置的小套管(约6

X36mm)(图1-2),此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。

3.吸管(又称移液管，pipette)

(1)玻璃吸管(glasspipette)微生物学实验室通常要准备1、5、10ml的刻度玻璃

吸管(图1-3,A)。与化学实验室所用的不一致，其刻度指示的容量往往包含管尖的液体

体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有的时候称之“吹出”吸管。市售细菌学用吸

管，有的在吸管上端刻有“吹”字。

除有刻度的吸管外，有的时候需用不计量的毛细吸管，又称滴管(图1-3,B),来吸

取动物体液与离心上清液与滴加少量抗原、抗体等。

(2)活塞吸管(pistonpipette)要紧用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或者微

量加样器。其外形与结构如图1-4,除塑料外壳外，要紧部件有按钮、弹簧、活塞与可装卸

的吸嘴。按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进与放出液体。其特点是容量固定,

使用时不用观察刻度，操作方便、迅速。国内产品通常每个活塞吸管固定一种容量，分别有

5、10、20、25、50、100、200、500、1000口1等不一致容量。而精制的活塞吸管每个在一

定的范围内可调节几个容积，比如在5—25口1的范围内，可调节5、10、15、20、25u1

五个不一致的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用毕

只需调换吸嘴或者将吸嘴洗净，消毒后再行使用。

活塞吸管是国外70年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免

疫学与使用同位素等的科学实验中。

4.培养皿(petridish)

常用的培养皿(图1-5),皿底直径90mm,高15mm。培养皿通常均为玻璃皿盖，但有

特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能汲取水分，使培养基表面干燥，比如测定抗生素生物

效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。

在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数与

测定抗生素、噬菌体的效价等。

5.三角烧瓶(Erlenmeyerflask)与烧杯(beaker)

三角烧瓶有100、250、500.1000ml等不一致的大小，常用来盛无菌水、培养基与摇瓶

发酵等。常用的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基与药品。

6.注射器(injector)

通常有1、2、5、10、20、50ml等不一致容量的注射器。注射抗原于动物体内可根据需

要使用1、2与5ml的；抽取动物心脏血或者绵羊静脉血可使用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100口1等不一致的大小。通常在免疫学或者纸层析等实验

中滴加微量样品时应用。

7.载玻片(slide)与盖玻片(coverslip)

普通载玻片大小为75X25mm,用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为18X

18mm。

凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝(图I-6),作悬滴观察活细菌与微室培养

用。

8.双层瓶(doublebottle)

由内外两个玻璃瓶构成(图I-7),内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时

使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。

9.滴瓶(dropperbottle)

用来装各类染料、生理盐水等(图1-8)。

10.接种工具

接种工具有接种环(inoculatingloop)、接种针(inocula-tingneedle)＞接种钩

(inoculatinghook)、接种铲(inocula-tingshovel)、玻璃涂布器(glassspreader)

等(图1-9)。制造环、针、钩、铲的金属可用钳或者镖，原则是软硬适度，能经受火焰反

复烧灼，又易冷却。接种细菌与酵母菌用接种环与接种针，其伯丝或者银丝的直径以0.5mm

为适当，环的内径约2mm,环面应平整。接种某些不易与培养基分离的放线菌与真菌，有的

时候用接种钩或者接种铲，其丝的直径要求粗一些，约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单

个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或者将玻棒一端烧红后压扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一

项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别与沾

污程度等的不一致而是完全不一致的。现分述如下：

1.新玻璃器皿的洗涤方法

新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液通常用2%的盐

酸或者洗涤液(见本小节“3”)。浸泡后用自来水冲洗干净。

2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法

(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或者海绵沾上肥皂或者洗衣粉或者去污

粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器

皿上的油污。洗衣粉与去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次

甚至10次以上充分冲洗，或者可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或

者有空心格子的木架(图IT0)上，在室内晾干。急用时可盛于框内或者搪瓷盘上，放烘

箱烘干。

玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠,

则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。

装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚

皂溶液(来苏尔)或者0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或者煮沸半小时，再用上法洗涤。

带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

盛放通常培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或者做科

研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸镭水淋洗三次，晾干或者烘干后备用。

(2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或者染料溶液等的玻璃吸管(包含毛细吸管)，

使用后应立即投入盛有自来水的量筒或者标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。量筒或者标

本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破旧。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶

部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后

再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片

刻。必要时再用蒸储水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。

吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液或者0.25%新洁尔灭

消毒液的量筒或者标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。

吸管的内壁假如有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。

(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或者浸在

二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或者脱脂棉花擦试,

立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.5—2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸储

水换洗数次，待干后浸于95%酒精中储存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤与

储存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。

检查过活菌的载玻片或者盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或者0.25%新洁尔灭溶液中浸

泡24小时，然后按上法洗涤与储存。

3.洗涤液的配制与使用

（1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：

浓溶液重铭酸钠或者重铭酸钾（工业用）50g

自来水150ml

浓硫酸（工业用）800ml

稀溶液重格酸钠或者重铭酸钾（工业用）50g

自来水850ml

浓硫酸（工业用）100ml

配法都是将重格酸钠或者重铭酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐

徐加入浓硫酸，边加边搅动。

配好后的洗涤液应是棕红色或者桔红色。贮存于有盖容器内。

（2）原理重铭酸钠或者重铭酸钾与硫酸作用后形成铭酸（chro-micacid）,酪酸的

氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。

（3）使用注意事项（a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，

会使玻璃变质，因此切忌到时不记得将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服与皮肤应立

即用水洗，再用苏打水或者氨液洗。假如溅在桌椅上，应立即用水洗去或者湿布抹去；（b）

玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃与瓷质器皿,

不适用于金属与塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是

由于有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污

迹都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，

但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。

三、空玻璃器皿的包装

1.培养皿的包装

培养皿常用旧报纸密密包紧，通常以5—8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多

于8套不易操作。包好后行于热灭菌。如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包,

铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图IT1）,此框架可自圆筒

内提出，以便装取培养皿。

2.吸管的包装

准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm长的棉花，以免

使用时将杂菌吹入其中，或者不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液

体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端,

与报纸约呈45度角（图IT2）,并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入

报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭

菌。

假如有装吸管的铜筒（图1-13）,亦可将分别包好的吸管一起

装入铜筒，进行干热灭菌；若估计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接

装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用

手持粗端拔出。

3.试管与三角烧瓶等的包装

试管管口与三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十九），然后在棉花塞与管

口与瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞

后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于储存期避

免灰尘侵入。

空的玻璃器皿通常用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加

一层牛皮纸。

假如试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。

II.环境中的微生物

由于微生物是肉眼看不见的，因此初学微生物学的学生常不明白外界环境与所有与外界

接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水与土壤中，

桌、椅与板凳的表面，衣服与身体的皮肤、粘膜（比如鼻腔、口腔、喉头等的粘膜）等处,

因此，能够说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立

起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，由于这样才能体会到无菌技术与环境卫生的

必要性，才能防止外界微生物对培养物的污染，才能防止病原性细菌或者病毒通过手或者衣

服进入人体而引起传染。

从周围环境与体表各部取样生长出来的微生物，尽管大多数属正常菌群，但当进入破旧

的皮肤或者传入口内或者眼睛等处也会引起传染，这一方面是由于通过培养，微生物的量大;

另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称之条件致

病菌），因此务必全面阅读操作步骤与听从指导者的说明，特别是用过的棉签与工作完毕后

的培养物等均要放在指定的容器内，接种环不仅在用前务必烧灼灭菌，而且用后也应立即烧

灼。这是整个微生物学实验课程与今后进行微生物学实验时均需注意的。

下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或者把手）与人的头发、皮肤、洗

手前后的手指与鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养1—2天后，观察并比较不

一致来源的微生物生长的数量与类型。

实验一实验室环境与人体表面微生物的检查

一、目的要求

1.证明实验室环境与体表存在微生物。

2.比较来自不一致场所与不一致条件下细菌的数量与类型。

3.体会无菌操作的重要性。

二、基本原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不一致来源的样品接种于培养基

上，在37c温度下培养，1一2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一

个可见的细胞群体的集落，称之菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，比如菌

落的大小，表面干燥或者湿润、隆起或者扁平、粗糙或者光滑，边缘整齐或者不整齐，菌落

透明或者半透明或者不透明，颜色与质地疏松或者紧密等。因此，可通过平板培养来检查环

境中细菌的数量与类型。

三、器材

肉膏蛋白陈琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或

者煤气灯，记号笔（或者蜡笔），废物缸。

四、操作步骤

每组在“实验室”与“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或者由教师指定分配,

最后结果供全班讨论。

1.写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号通常写

在皿底上。假如写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用

记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或者无菌室空气

或者头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

2.实验室细菌检查

（1）空气将一个肉膏蛋白陈琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培

养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白陈琼脂平板放在无菌室或者无人走动的其他实验

室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。

（2）实验台与门的旋钮

（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图HT。

（b）取棉签左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘与小指、无名指夹持

棉塞（或者试管帽），将其取出（图n-2,B）,将管口很快地通过煤气灯（或者酒精灯）

的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指与食指将棉签小心地取出（图n-2,c）o

放回棉塞（或者试管帽）（图n-2,D）,并将空试管放在试管架上。

（c）弄湿棉签左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或者试管帽）并烧灼管口，将棉

签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管

口，放回棉塞（或者试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。

（d）取样将湿棉签在实验台面或者门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。

（e）接种按图11-3,A在火焰旁用左手拇指与食指或者中指使平皿开启成一缝。再将

棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图II-3,B）,立即闭合皿盖。并按图H-2,

E与F,将原放棉签的空试管拔出棉塞（或者试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试

管放回试管架。

（f）划线另取接种环在火焰上灭菌，如图n-4,先将环端烧热（图n-4,1）,然后

将接种环提起垂直放在火焰上（图II-4,2）,以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种

环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快

地来回通过火焰数次（图n-4,3）o

左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处

试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半

处（图II-3,C）o注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺

破琼脂。

闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接

种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图n-3,D从上向下来回划线至1/2处。

烧灼接种环，转动平板，按图II-3,E,划最后1/4,立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放

回原处。

整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

3.人体细菌的检查

（1）手指（洗手前与洗手后）

（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每

次写标签时是必不可少的）。

（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

（c）用肥皂与刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来

回移动，盖上皿盖。

（2）头发在掀开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼

脂平板表面，然后盖上皿盖。

（3）咳嗽将去盖琼脂平板放在离口约6—8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上

皿盖。

（4）鼻腔

（a）按照实验台检查法的步骤（b）与（c）,取出棉签，并将其弄湿。

（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

（c）按实验台检查法的步骤（e）与（f）,接种与划线，然后盖上皿盖。

4.将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37℃培养箱，培养1—2天。

5.结果记录方法

（1）菌落计数在划线的平板上，假如菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌

落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。

（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不一致的菌落类型。但要注意，假

如细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者者限制了菌落生长而变得很小，因而外观

不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：

（a）大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、

中、小的标准，或者由教师指出一个大小范围。

（b）颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

（c）干湿情况干燥、湿润、粘稠。

（d）形态圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

（f）透明程度透明、半透明、不透明。

（g）边缘整齐、不整齐。

五、实验报告

1.结果

（1）将你自己的平板结果记录于下表中。

样品菌落数菌落特征描写

来源（近似值）类型大小形态干湿图度透明度颜色边绦

1.1

2

3

4

5

2.1

2

3

4

5

（2）与其他同学所做的结果进行比较。

2.思考题

（1）比较各类来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

（2）人多的实验室与无菌室（或者无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落

类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？

（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有

什么体会？

m.显微镜的构造、性能与使用方法

由于微生物个体细小，因此我们务必用显微镜来研究它们的个体形态与细胞结构。熟悉

显微镜与掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。

现代显微镜通常能够分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类

显微镜又可根据不一致的情况分成若干类型，现列表如下：

明视野显微镜

按照明技术暗视野显微镜

荧光显微镜

'相差显微镜

可见光显微镜按像的形成分干涉相差显微镜

,偏光显微镜

光学显微镜

显.倒置显微镜

微按镜体结构分实体显微镜

镜比较显微镜

.紫外光显微镜

不可见光显微镜红外光显微镜

姗线显微镜

透射电子显微镜

电子显微镜

非光学显微镜扫描电子显微镜

超声波显微镜

本部分包含普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜与电子显微镜四个实验。目的

在于使同学们通过这四个实验，对两种类型的显微镜有较全面的熟悉，并重点掌握明视野普

通光学显微镜的使用。关于电子显微镜则着重熟悉其工作原理，并要求掌握制作电子显微镜

标本的基本技术。

实验二普通光学显微镜

一、目的要求

1.熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2.学习并掌握油镜的原理与使用方法。

二、显微镜的基本构造

显微镜由机械装置与光学系统两大部分构成(图IIIT)。

1.机械装置

镜座(base)与镜臂(arm)镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固

定式与活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。

镜筒(bodytube)是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒与双筒

两种，单筒又可分为直立式与后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。

双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不一致的情况下调节使用。

转换器(nosepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜，可使每

个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。

载物台(stage)又称镜台，为方形或者圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通

光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器,

将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到

变换的视野。

调焦装置是调节物镜与标本间距离的机件，有粗动螺旋(coarseadjustment)即粗调

节器与微动螺旋(fineadjustment)即细调节器，利用它们使镜筒或者镜台上下移动，当

物体在物镜与目镜焦点上时，则得到清晰的图像。

2.光学系统

物镜(objective)物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接

物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量与分辨能力的重要部件。物镜上通常

标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等要紧参数。如：NA0.30；10X；160/0.17；

16mm。其中"NA0.30”表示数值孔径(numericalaperture,简写为NA),"10X"表示

放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度与所需盖玻片厚度(mm),16mm表示焦距。

目镜(ocularlens)装于镜筒上端，由两块透镜构成。镜把物镜造成的像再次放大,

不增加分辨力，上面通常标有7X、10X、15X等放大倍数，可根据需要选用。通常可按与

物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜

的放大倍数过大，反而影响观察效果。

聚光器(condenser)光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度与

造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜与虹彩光圈(irisdiaphragm)

构成，聚光镜由透镜构成，其数值孔径可大于1,当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜与

载玻片之间加香柏油，否则只能达到1.0。虹彩光圈由簿金属片构成，中心形成圆孔，推

动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度与虹彩光圈的大小，可得到适当的光照

与清晰的图像。

光源(lightsource)较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮

开关来操纵；老式的显微镜大多是使用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一

面是平面，另一面是凹面。在使用低倍与高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或者光线

弱时可用凹面反光镜。

滤光片(filter)可见光是各类颜色的光构成的，不一致颜色的光线波长不一致。如只

需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，能够提高分辨力，增加影像的反

差与清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各类颜色的，分别透过不一致波长的

可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。

3.成像原理

普通光学显微镜的成像原理如图山-2所示。

三、油镜物镜的基本原理

微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10X)、高倍物镜(4mm,40

-45X)与油镜(1.8mm,95—100X)三种。油镜通常标有黑圈或者红圈，也有的以“01

(oilimmer-sion)字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不一致放大倍数的目

镜，可使被检物体放大1000—2000多倍。从图III-3中可看出油镜的焦距与工作距离(标

本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离)最短，光圈则开得最大，因此，在使用

油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。

使用时，油镜与其他物镜的不一致是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油

质，称之油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=l.52,与玻璃相同。当光线

通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。假如玻片与物镜之间的介质为空

气，则称之干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少,

这样就减低了视野的照明度(图III-4)。

利用油镜不但能增加照明度，更要紧的是能增加数值孔径，由于显微镜的放大效能是由

其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称之镜口角)的一半

正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

NA=n,sina

式中NA=数值孔径；

n=介质折射率；

a=最大入射角的半数，即镜口角的半数。

因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大(图HI-5),该角度的大小决

定于物镜的直径与焦距。同时，a的理论限度为90°,sin90°=1,故以空气为介质时(n=l),

数值孔径不能超过1,如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入

射角为120。，其半数的正弦为sin60°=0.87,则:

以空气为介质时：

NA=1XO.87=0.87

以水为介质时：

NA=1.33X0.87=1.15

以香柏油为介质时：

NA=1.52X0.87=1.32

显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成

正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力

愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的

可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或者纳米，这

实际上是把分辨力与最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表

示的。

能辨别两点之间最小距离=—

式中入=光波波长。

我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55nm,假如数值孔径为0.65的高倍物镜，

它能辨别两点之间的距离为0.42口m。而在0.42um下列的两点之间的距离就分辨不出，

即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更

大的物镜，增加其分辨力才行。比如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的

最小距离=点7=0.22|^。

因此，我们能够看出，假如使用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65),与放大率为

24倍的目镜，尽管总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42um。假如使用放大

率为90倍的油镜(NA=1.25),与放大率为9倍的目镜，尽管总的放大率为810倍，但却

能分辨出0.2211m间的距离。

四、器材

显微镜，显微镜灯，香柏油，二甲苯；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)染色玻片标本，

枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)染色玻片标本。

五、操作步骤

1.观察前的准备

(1)置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正，

通常用左眼观察，右眼便于绘图或者记录，两眼务必同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右

眼均能观察。

(2)调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置

与镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或者显微镜灯照明。

调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线

较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线

较弱的天然光源或者人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检

查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或者缩小光圈、

升降聚光器、旋转反光镜调节光线。

2.低倍镜观察

检查的标本需先用低倍镜观察，由于低倍镜视野较大，易发现目标与确定检查的位置。

将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物

镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约0.5cm处，由目镜观察，如今可适当地缩

小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物

像出现后再用细调节器调节到物像清晰时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到

合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。

3高倍镜观察

将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然

后由目镜观察，并认真调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物

像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视

野中心，准备用油镜观察。

4.油镜观察

（1）用粗调节器将镜筒提起约2cm,将油镜转至正下方。

（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

（3）从侧面凝视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎

与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏

镜头。

'°（4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升,

直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，务必

再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

（5）用同样的方法观察枯草芽抱杆菌染色标本。

（6）观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯

（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌

用手或者其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。（7）将各部分还

原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜

与聚光镜发生碰撞危险。

六、实验报告

1.结果

分别绘出你在低倍镜、高倍镜与油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽抱杆菌的状

态，包含在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数与总放大率。

2.思考题

（1）在使用高倍镜与油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？

（2）用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？

（3）在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活

标本好，为什么？

实验三暗视野光学显微镜

一、目的要求

1.熟悉暗视野显微镜的基本原理及用途。

2.学习并掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品的基本技术。

二、基本原理

生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。暗视野显微镜的原理与来自缝

隙的一束强光通过暗室时，可清晰地看到其中细微灰尘的现象是一样的，即给样品照明的光

不直接穿过物镜，而是由样品上反射或者折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于

反差增大了，使样品能够看得更清晰。因用暗视野法能够在黑暗的视野中看到光亮的菌体,

故在观察生活细菌及细菌运动经常使用此法。

暗视野显微镜的构造要紧是使用一种特殊的聚光器,在聚光器的下方中央为圆形黑盘所

遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光

可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时，只需

将明视野显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光器下面

的滤光镜支架上放一片星形挡板（stardiaphragm）（图III-6）构成暗视野，这种方法适用

于低倍镜观察。

在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，因此暗视野也被用来区分死、活细

胞，此技术现已被用于各类酵母细胞的死、活鉴别。止匕外，暗视野显微镜关于观察娇弱的微

生物，如梅毒密螺旋体（Treponemapallidum）特别有用。

三、器材

酿酒酵母（Saccharomy-cescerevisiae）；

暗视野显微镜，载玻片，盖玻片，无菌水。

四、操作步骤

1.选厚薄在L0—1.2mm的干净载玻片一块，滴上酿酒酵母悬液，加盖玻片（注意切

勿有气泡存在）。

2.将聚光镜光圈调至1.4。

3.光源的光圈孔调至最大。

4.在聚光器上放一大滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触（不

能有气泡发生）。

5.用低倍物镜及7X目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出

现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点（图III-7）,光点愈小愈好，由此点将聚

光器上下移动时均使光点增大。

6.换上所需目镜与高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。

7.在盖玻片上滴一滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。

五、注意事项

1.进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚

光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，从而不能得到暗视野照明。

2.在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节与调焦，使焦点与被检物

体一致。

3.由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（NA=1.2-1.4）,焦点较浅，因此，过厚

被检物体无法调在聚光镜焦点处，通常载玻片厚度为1.0mm左右，盖玻片厚度宜在0.161nm

下列，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的像。

六、实验报告

思考题

（1）观察活细胞的个体形态，你认为用显微镜的明视野好？还是暗视野好？为什么？

（2）你所观察到的酿酒酵母，在暗视野中能否区分死、活细胞？

（3）暗视野观察时，所用的载玻片、盖玻片有何要求？为什么？

实验四相差显微镜

一、目的要求

1.熟悉相差显微镜的基本原理与用途。

2.学习掌握相差显微镜的操作技术。

二、基本原理

暗视野显微镜能够看到活细胞的外部形态，但是看不清内部结构。相差显微镜不仅能观

察活细胞的形态，而且还能看到细胞内部结构与细胞分裂的连续过程。

光线通过透明物体如活细菌细胞后，由于受透明物体中密度与折射率不一致的物质的影

响，部分光线变成了绕射光，光波的相位发生变化，而这种相位差不表现为明暗与颜色上的

差异，不能在显微镜视野中观察到。相差显微镜就是将通过透明物体的直射光延迟或者提早，

并与绕射光产生干涉，使相位差变为振幅差。假如产生的干涉为相长干涉（图IH-8,R组光

线），则振幅的同相量相加而变大，我们便看到较亮的部分；假如所产生的干涉为相消干涉

时（如图IH-8,S组光线），则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。这样，变相位

差为振幅差的结果，使原先透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观

察活细胞的细微结构。

相差显微镜成像原理与装置如图III-9所示。

在普通光学显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜：

（1）环状光阑

相差显微镜的聚光镜光阑是环状光阑。照明光线只能从环状的透明区进入聚光镜再斜射

到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光镜）。大小不一致的环状光阑成一转盘（图m-10,A）,

安装于聚光镜下面，更换放大率不一致的物镜时，要同时更换与其相应的光阑。

（2）相差物镜（镜头上标有PC或者PH字样）

物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的要紧装置。相板上与环状光阑相对应的

环状部分大多数是涂的汲取膜与推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线,

绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。通

常所用的相板推迟相位1/4,汲取80%的直射光，这样，就使直射光与绕射光的强度接近,

而相位差则增大或者减少。由于透明标本内部构造的折射率不一致，产生绕射光的相位就会

有不一致程度的推迟，绕射光与直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。

（3）绿色滤光片

为了获得良好的相差，最好用单色光线照明，通常选用绿色光线。

（4）合轴调整望远镜

为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，务必拔出目镜，装上特别的低倍望

远镜（图IIITO,B）,使相板的暗环与环状光阑的明环合轴（图IIIT1）。

三、器材

相差显微镜，1.0mm下列载玻片，0.16-0.17mm下列盖玻片；酿酒酵母水浸片，枯草

芽抱杆菌水浸片。

四、操作步骤

1.将酿酒酵母水浸片置载物台上，夹好。

2.转动聚光器下面的环状光阑转盘至“0”，并将光圈开到最大。

3.通过普通目镜与低倍相差物镜（如10义）调节焦距，看清标本。

4.转动转换器，使油镜相差物镜（90X）对准标本，同时转动环状光阑转盘至40,使

与所用的物镜相符。

5.用细调节器调节焦距，使物像清晰。

6.取下目镜，换上合轴调节望远镜，转动望远镜使聚光镜中的亮环与物镜中的暗环看

清晰。

7.转动聚光镜左右二侧的调节杆，使两环重合。

8.取下望远镜换上目镜进行观察，每更换标本或者改变不一致倍数的相差物镜时，都

务必依上法重新合轴调节。

9.换上枯草芽抱杆菌的水浸片进行观察（务必先进行合轴调节）。

五、实验报告

1.结果

绘出你用相差显微镜所观察到的酿酒酵母与枯草芽泡杆菌的形态结构。

2.思考题

为什么说相差显微镜适于观察活细胞的细微结构？

实验五电子显微镜

一、目的要求

1.熟悉电子显微镜的工作原理。

2.学习并掌握制备电镜标本的方法。

二、基本原理

1.电子显微镜的分辨力与放大率

电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。发射电

子流的电子源部分称之电子枪，电子枪由发射电子的“V”形鸨丝及阳极板构成，在高真空

中，鸽丝被加热到白