马铃薯病毒鉴定技术规程

1马铃薯病毒鉴定技术规程本文件规定了规定了内蒙古马铃薯病毒鉴定技术的术语和定义、检验对象、取样、鉴定方法和判定规则。本文件适用于内蒙古马铃薯的病毒鉴定。环境相似的马铃薯产区可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T40974-2021核酸样本质量评价方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1马铃薯Solanumtuberosum别称土豆、地蛋、洋芋等。是茄科茄属一年生草本植物。3.2反转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)提取洋葱、大蒜检材的总RNA，以其中的mRNA为模板，利用反转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。4检测对象4.1洋葱主要病毒a）甘薯卷叶病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCVb）马铃薯A病毒（PotatovirusA，PVAc）番茄黑斑病毒（Tomatoblackringvirus，TBRVd）马铃薯卷叶病毒（Potatoleafrollvirus，PLRVe）苜蓿花叶病毒（Alfalfamosaicvirus，AMVf）马铃薯纺锤块茎类病毒（Potatospindletuberviroid，PSTVdg）马铃薯奥古巴花叶病毒（Potatoaucubamosaicvirus，PAMV2h）烟草坏死病毒（Tobacconecrosisvirus，TNVi）马铃薯V病毒（PotatovirusV，PVVj）马铃薯Y病毒（PotatovirusY，PVYk）烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRVl）马铃薯M病毒（PotatovirusM，PVMm）马铃薯帚顶病毒（Potatomop-topvirus，PMTVn）马铃薯S病毒（PotatovirusS，PVSo）黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMVp）安第斯马铃薯潜隐病毒（Andeanpotatolatentvirus，APLVq）马铃薯X病毒（PotatovirusX，PVXr）番茄环纹斑点病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSVs）番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWVt）马铃薯黄矮病毒（Potatoyellowdwarfvirus，PYDV5取样5.1取样方法5.1.1五点取样法对于洋葱、大蒜无症状的种植区或面积较大的种植区采用5点取样法随机抽取。1000株以内抽检10株（含1000株）；1000株～10000株（含10000株）,首个1000株抽检10株之后每增加1000株增检5株，不足1000株按1000株计；超过10000株，第1000～10000株按上述方法抽样，之后每增加1000株增检20株，不足1000株按1000株计。5.1.2根据症状观测取样感染病毒病的洋葱、大蒜极易表现出矮化、扭曲、黄化、褪绿以及坏死斑等症状。根据在洋葱、大蒜上观测的各症状表现可进行有效取样。5.2取样部位疑似病毒病感染的马铃薯植株，症状如植株矮小，块茎萎缩，叶片皱缩斑驳等。取马铃薯植株茎秆和叶柄放置于自封袋内，4℃保存不超过24h或液氮预冷后立即放置于-80℃长期保存备用，薯块存放置干燥处备用。6反转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR法)鉴定详见附录A。7判定规则RT-PCR检测呈阳性反应的判定为携带病毒。脱毒马铃薯带毒率为0。3反转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR法)鉴定A.1试剂盒A.1.1植物DNA、RNA提取试剂盒：选择适合提取含有多糖多酚材料的DNA、RNA试剂盒。B.1.2反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。B.1.3PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。A.2引物病毒PCR检测特异性引物见表A.1表A.1马铃薯病毒的特异性引物病毒引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）SPLCVSPLCV-FACTTCGAGACAGCTATCGTGSPLCV-RACGAATTCAAGATGGATGTCPVAGATGTCGATTTAGGTACTGCTG273TCCATTCTCAATGCACCATACTBRVTBRV-FGGCATTTCTTATAGAGAATATCCCTCC277TBRV-RGCTTTTTGCAGAAAAYATTTTATCATPLRVPLRV-FCGCGCTAACAGAGTTCAGCC336PLRV-RGCAATGGGGGTCCAACTCATAMVAMV-FCCATCATGAGTTCTTCACAAA351AMV-RTCGTCACGTCATCAGTGAGACPSTVdPSTVd-FCACCCTTCCTTTCTTCG359PSTVd-RAAAACCCTGTTTCGGCGGGAPAMVPAMY-FACCCAAGCGTTCCTATATACTC360PAMV-RGGTCAAATCATTGCCAGCAATCTNVTNV-FAAGATACAACACATTACGATCG416TNV-RACTAGACGTTCATTGAGGGATTGAPVVPVV-FCTAACGCAAGGGCAACTCAG434PVV-RCAGTGCTGCTGCCTTCATCT4PVYPVY-FGGCATACGGACATAGGAGAAACT447PVY-RCTCTTTGTGTTCTTCTCTTGTGTTRVTRV-FGACGTGTGTACTCAAGGGTT463TRV-RCAGTCTATACACAGAAACAGAPVMPVM-FACATCTGAGGACATGATGCGC520PVM-RTGAGCTCGGGACCATTCATACPMTVPMTV-FATGGCTGAAAACAGAGGTGA531PMTV-RCTATGCACCAGCCCAGCGTAAPVSPVS-FTCTCCTTTGAGATAGGTAGG602PVS-RCAGCCTTTCATTTCTGTTAGCMVCMV-FGTTTATTTACAAGAGCGTACGG650CMV-RGGTTCGAARRWATAACCGGGAPLVAPLV-FCACCCAAATGGACCTCTGCTGTGTGCTA688APLV-RTGCTTCCCTTTTTCAATTCPVXPVX-FATGTCAGCACCAGCTAGCA711PVX-RTGGTGGTGGTAGAGTGACAATZSVTZSV-FTGGTTAAAAAGACAGATCATTGCT852TZSV-RCTACTTGCCAACATGTCTAACGTCTSWVTSWV-FTCACTGTAATGTTCCATAGCAA861TSWV-RAGAGCAATYGTGTCAATTTTATTCPYDVPYDV-FATATTCATTTCCAGGCTTGCATT890PYDV-RATCTGATACTGGCCTACCCTTA.3操作步骤A.3.1马铃薯各病毒DNA或RNA提取A.3.1.1提取方法按照试剂盒操作说明书提取。A.3.1.2判定规则5提取的RNA质量判定参照GB/T40974-2021执行。DNA判定采用电泳法检测，RNA有两条条带，条带清晰明亮；微量分光光度计测得OD260/OD280比值1.8以上、浓度30ng/µL以上的，以此为模板直接进行反转录或置于-80℃条件下保存。不符合以上指标的需重新提取。A.3.2逆转录按照反转录试剂盒操作说明书提取。A.3.3病毒检测A.3.3.1PCR扩增A.3.3.1.1PCR反应体系按说明书指定的剂量在PCR反应管中依次加入多聚酶，病毒特异性检测上下游引物，cDNA模板或提取的样本DNA，无菌蒸馏水。目标病毒对应检测引物见表A.1。A.3.3.1.2PCR反应程序将PCR管放入PCR仪中，按说明书指定程序进行聚合酶链式反应，待测病毒引物退火温度按指定值进行输入，延伸时长可根据片段大小适当调整，采用凝胶电泳法检测反应产物。A.3.3.2电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶，每个泳道加入5µL的PCR产物，110V恒压电泳30分钟。A.3.3.3凝胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于蓝光切胶仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增