题目鸡传染性支气管炎毒株

摘要 摘要 引言 实验材 其 HQ毒株P10和P110N基因的克隆与序列测定分 4.11病毒RNA提 反转录反应(Reverse pGEM-TEasy载体与纯化PCR产物的连 4.1.10HQ4.1.10HQ毒株P10与P110N基因序列测定与分析比 试验结 HQ毒株P10和P110N基因的克隆与序列测定分 HQ毒株P10与P110N基因序列测定与分 讨 结 参考文 致 序列测定分析比较，N294位、355位、634位、86012024NNHQNHQ关键词：鸡传染性支气管炎病毒HQ毒 N基Abstract：TheuseofSPFchickwillcontinuousHQstrainattenuated,tothe110AnalysisandcomparisonofsequencingNgeneonP10andP110,Ngenein294,355,634,and1202changes,andresultedina4aminoacidresiduesmutated.ThisstudyprovidestheforthecorrelationbetweenbeforeandafterHQstrainpassagedNgenechangeandstrainsofserotypesandKeywords：Avianinfectiousbronchitis(IB)；HQ Ninfectiousbronchitis，IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。病毒血清型复杂，来，IB的流行呈上升趋势，尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎的发生，给养禽业造成RNA，全长27.6kb，主要结构RNARNAIBVS1NIBV的进化中高度保守；但近年研究发现，N基因也存在广泛的变异，并且这些变异分布于抗原表位和相关功能区HQbronchitis，IB传染病之二。由鸡传染性支气管炎病毒（Avianinfectiousbronchitis，IBV）引起的一种急1-4周龄的雏鸡[1，2]IB巨大损失[3]；IB可侵害生殖系统，发生输卵管炎，导致输卵管堵塞，造成产蛋障碍综合征[4]。该病呈世界流行，在近年来成为了严重危害世界养禽业的传染病之一[5-8]。IBV在国内但鸡传染性支气管炎病毒不会垂直传播[9]但鸡传染性支气管炎病毒不会垂直传播[9]RNA和磷酸化核蛋白组成IBVC定等研究十分有效的方法。IBVNDVNDV（Spike，S（Envelope，E（S（M（EmRNA1、mRNA3mRNA5编码。N蛋白。NmRNA6编码，是病毒内部核衣壳的组成部分，由是决定了病毒的复制和组装的重要蛋白[15]。N蛋白的组成中碱性氨基酸占17.2%-19.6%，其中包括199个组氨酸、42个赖氨酸和3个精氨酸，80%IBVFigThestructureofIBVNRNA上，参BELISA2.7NIBVS1NIBV的进化中高度保守；但近年研究发现，NHQ科学依据[17]科学依据[17]IBV3.1GIBCO 生工生物工程（上海）TRIzolInvitrogen公司，DNAMarkerDL2000购自宝生物工程（大连）有™ReverseTranscriptionSystem（A5001）反转录试剂盒购自promega公司，2×TaqMasterMix购自天根生化科技有限公司，JM109BioTeke3.2PHSW-CJ-LCN-BIOTEKSartoriusarium631DI-3Thermo公司上海雷磁(pHS-单道移液器（0-单道移液器（0-100-PCR仪SPFSPF44.1HQP104.11RNARNA提取。Rnase-free1.5mL离心管，加入300μL混合液和400μLTRIzol，剧烈振荡后于4℃、12000r/min离心15min。沉淀30min，之后4℃、13000rpm离心15min，弃上清。RNA沉淀溶解，立即进行反转录反应，或-20℃保存备用。4.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer4.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer目的片上游引物下游引物4.1.3（1）RNARandomRNA最高5μg/反应Nuclease-Free10RNA与引物的混合液70℃变性5min，随后置于冰上5GoScript™5XReactionBufferMgCl2,25mMPCRNucleotideMix,GoScript™Reverse0.5（5）cDNA530（5）cDNA53015min4.1.4PCRPCR50μLS1PCR9595557272451121032NPCR959553727245111min301035为130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μ为130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μLPCR产物于1%30s每1克琼脂糖凝胶加1mLBindingBuffer，55℃水浴，振荡数次直至凝胶完全溶解。300μLBindingBuffer加入离心2min2min；然后13000r/min离心2min。取5μLPCR4.1.6pGEM-TEasypGEM-TEasy载体PCR产物T4DNA104（1） Gal平 2 / IP 5μL加入到冰浴中的2个1.5mLJM109（－70℃冻存，冰浴5min30min，冷却2min。，37℃150（7）1,000rpm离心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上，将平板置于（7）1,000rpm离心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上，将平板置于37℃生化培养箱中过夜培养（12～16h。将长有菌落的平板置于4℃中3～4h，挑选白色、单个菌落接种到5mLLB培养基（含氨苄青霉素50μg/mL，37℃振荡培养12～16h。提取的重组质粒在1%PCR212.5118.5下游引物S1PCR959555727251121032NPCR95955372725111min301032PCR反应结束后进行1%琼脂糖凝胶中电泳，参数设置为130V、50mA、30min4.1.10HQP10P110N4.1.10HQP10P110N挑选阳性质粒送至上海博尚生物科技有限公司测序，将测得的N55.1HQP10P110N5.1.1NRT-PCRcDNAWF、WRHF、HRS1基因、N1图 Fig.2RT-PCRresultsofNM：DNAMarkerDL2000;1：HQP10N2：HQP110N DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP102:NgeneofHQ5.1.2OMEGA1%2图3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNA图3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110N基因M:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQP1105.1.3PCR3，得到约图NPCRFig.4TheidentificationofrecombinantplasmidPCRproductsofNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110NM:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQ5.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P10N基因由12305.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P10N基因由1230个碱基组成，5，分别在NHQN基因序列推导出的氨基酸个数都为40971个，占17%。HQP110P10N基因推导氨基酸序列相比，有4个氨基酸残基发生突变（见6：在NNetphos2.0ServerHQP10P110N蛋白的潜在磷酸化位点，可知传N蛋白潜在磷酸化位点的数量和位置都没有变化。2HQP10P110NTable.2ThepotenialphosphorylationsitesofHQP10andP110N图HQP10ThepotentialphosphorylationsitesofHQP10N图6HQP110图6HQP110N ThepotentialphosphorylationsitesofHQP110N（4）NDNAMANHQP10HQP110N蛋白的疏水性，图6N图7HQP10P110N ThecomparisonofhydrophobicitybetweenHQP10andP110N6NIBVIBV鸡HuangYNIBVIBV鸡HuangYP等对台湾三株鸡胚致弱毒株（TW1171/92、2296/95、2575/98）3’端进行测序分析比较。结果发现3NNN71202位发生改变，并导致有4HQN基因的改HQ毒株的毒力发生改变可能有关。SaifYM.禽病学[M].112005:108-19（20631-Johnson,R.B.etal.:AvianDis.[J],1975,19:82-BayryJ,GoudarMS,NighotPK,KshirsagarSG,LadmanBS,GelbJJr,GhalsasiGR,GN,EmergenceofanephropathogenicavianinfectiousbronchitisviruswithanonelinIndia.ClinMicrobiol,2005,43:916- S,et[8]WangHN,WuQZ,HuangY,etal.IsolationandidentificationofinfectionsvirusfromchickensinSichuan,China[J].AvianDIS,1997,41:279-[9]王玉东，王永玲，张子春，等.鸡腺胃型支气管炎病毒的分离和鉴定[J].中国动物检疫，[10]SaifYM.禽病学[M].112005:108-[10]SaifYM.禽病学[M].112005:108-，2002,28618-宋显章,韩青松，涂宜强,等.鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展[J].畜牧与饲料科[17]N[J].2007,29：在本论文是在吴宝成老师的悉心指导下，进行试验和撰写完成的。在实验过程中，我学到了许多的新知识和科学的实验方法，更体会到了默默奋斗在一线广大科研人员的努力和辛劳及伟大。在这里，我要把最诚挚的谢意献给吴宝成老师！衷心感谢在实验中吴异健老师、张红星河吴晓萍老师的指导与帮助，以及研究生赛春春学长，江锦绣、洪艳艳学姐等全体实验室成员的帮助关心与支持。同时感谢在这实验过程中给予我帮助和支持的