T-LNSI 008-2024 人脐带间充质干细胞

ICS11.020CCSC05HumanumbilicalcordIT/LNSI008-2024 2规范性引用文件 3术语和定义 4符号和缩略语 6检验方法 7检验规则 9标签 10包装、储存及运输 11废弃物处理 附录A（规范性）细胞存活率检测细胞计数法 10附录B（规范性）细胞标志蛋白检测流式细胞法 12附录C（规范性）成骨分化检测茜素红S染色法 14附录D（规范性）成脂分化检测油红O染色法 16附录E（规范性）成软骨分化检测阿尔新蓝染色法 18附录F（规范性）成瘤性检测免疫缺陷小鼠检测法 20附录G（规范性）干细胞对淋巴细胞增殖抑制检测干细胞共培养法 22T/LNSI008-2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化的文件结构和起草规则》的规定起本文件由沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、沈阳市再生生物医学重点实验室提出。本文件由辽宁省免疫学会归口。本文件起草单位：沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、中国医科大学干细胞与再生医学研究室、沈阳干细胞与再生医学重点实验室、辽宁艾米奥干细胞与再生医学研究院、辽宁省细胞生物学学会、辽宁省生物技术协会、沈阳市干细胞与再生医学产业技术创新联盟、沈阳药科大学、中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属口腔医院、中国医科大学附属盛京医院、艾米奥国际干细胞医院。本文件主要起草人：庞希宁、庞然、施萍、单风平、王莉莎、赫甡、宋扬、徐东芬、荆晶、姜雯宇、高航、谢光麟、邵锡柱、王竟、孟涛、张美玲、聂宏光、郎宏鑫、刘晓玉、王喜良、张涛、赵峰、张殿宝、王瑞、李彩虹、李宏图、潘长伟、孔娟、王哲、王蔚、殷军、郭然、张宁、李晓航。1T/LNSI008-2024人脐带间充质干细胞本文件规定了人脐带间充质干细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、运输和废弃物处理要求。本文件适用于人脐带间充质干细胞的生产和检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS213丙型肝炎诊断WS273梅毒诊断WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》T/CSCB0001-2022《人干细胞研究伦理审查技术规范》GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则中华人民共和国药典（2020年版）全国临床检验操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1间充质干细胞mesenchymalstemcells2T/LNSI008-2024主要来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全是多种组织中，可在体外培养扩增，并在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。3.2人脐带间充质干细胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells来源于人脐带华氏胶组织，贴壁培养后呈纺锤形和梭形的成纤维细胞态，可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的间充质干细胞。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——疱疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型病毒性肝炎（HepatitisBVirus）HCMV——人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人类白细胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人类嗜T细胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-双加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干扰素-γ（Interferon-γ)TNF-α——肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)PCR——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）STR——短串联重复序列（ShortTandemRepeat）TP——梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）5技术要求3T/LNSI008-20245.1原材料和辅料5.1.1应符合T/CSCB0001-2022要求。5.1.2应建立供者细胞采集的供者评估与筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证供者和细胞的安全。5.1.3供体应筛查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并记录结果。5.2分离与培养方法5.2.1分离及提取采用组织块贴壁法从脐带华氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞。进行人脐带间充质干细胞原代培养。5.2.2人脐带间充质干细胞换液根据细胞的生长情况换液。5.2.3人脐带间充质干细胞传代传代操作应密度适宜、及时、迅速。5.2.4人脐带间充质干细胞冻存冻存细胞程序降温后置液氮中保存。5.2.5人脐带间充质干细胞复苏取出冻存管进行快速融化，离心洗涤后进行培养。5.2.6人脐带间充质干细胞溶液人脐带间充质干细胞溶液为均质状态，无絮状沉淀，细胞存活率≥90％。5.3关键质量属性5.3.1细胞形态细胞贴壁培养时呈纺锤形和梭形的成纤维细胞态，形态均一。4T/LNSI008-20245.3.2染色体核型正常核型应为46,XX或46,XY且400-550条段阶段未见染色体异常。5.3.3细胞存活率未冻存细胞存活率≥90%且冻存复苏后细胞存活率≥70%。5.3.4细胞标志蛋白CD105、CD73、CD90阳性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR阳性率≤2%。5.3.5三系分化具有成骨、成脂、成软骨的分化潜能。5.3.6成瘤性免疫缺陷动物（如小鼠）体内成瘤试验结果为阴性。5.3.7微生物真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP为阴性。5.3.8干细胞对淋巴细胞增殖抑制应满足下列要求：——共培养组与阳性对照组相比，白介素6、肿瘤坏死因子α表达下调，白介素10表达上调；——共培养组与阳性对照组相比，淋巴细胞增殖被显著抑制；——共培养组与阳性对照组相比，淋巴细胞亚群辅助性T细胞上调，细胞毒性T淋巴细胞下调。5.4过程控制5.4.1扩增、冻存、复苏等过程控制应符合T/CSCB0001-2022要求。5.4.2细胞STR检测结果应与供体细胞保持一致。5T/LNSI008-20246检验方法6.1细胞形态二维培养条件下，用明视场细胞显微镜×40倍进行观察。6.2染色体核型按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”项检验。6.3细胞存活率按照附录A的方法检验。6.4细胞表面标志物按照附录B的方法检验。6.5三系分化6.5.1成骨分化按照附录C的方法检验。6.5.2成脂分化按照附录D的方法检验。6.5.3成软骨分化按照附录E的方法检验。6.6成瘤性按照附录F的方法检验。6.7微生物6.7.1真菌按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”项检测。6T/LNSI008-20246.7.2细菌按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”项检测。6.7.3支原体按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“3301无菌检查法”项检测。6.7.4HBV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。6.7.5HCV按照WS213核酸法检验。6.7.6HIV按照WS293-2019核酸法检验。6.7.7HTLV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。6.7.8EBV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。6.7.9HCMV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。6.7.10TP按照WS273核酸法检验。6.8干细胞对淋巴细胞增殖抑制检测按照附录G的方法检测。7检验规则7.1抽样方法和数量7T/LNSI008-20247.1.1在一个生产周期中，同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制备出来的产品为一批。7.1.2在同一批的产品中随机抽取3个最小包装单元。7.2出厂检验7.2.1每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。7.2.2出厂检验项目应包括5.3规定的所有项目。7.3复核检验若客户需要，应由第三方专业细胞检验机构或实验室进行复核检验，检验项目应包括第5章规定的所有项目。7.4判定规则7.4.1出厂检验项目全部符合5.3规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。7.4.2复核检验项目全部符合5.3规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。8使用说明应至少包括以下内容：c）细胞数量；e）生产批号；f）生产组织；i）使用方法；8T/LNSI008-2024j）执行标准号；k）生产地址；l）联系方式；n）注意事项。注：根据用户需求，可标注内毒素含量。9标签应至少包括以下内容：c）细胞数量；e）生产组织；f）生产日期。10包装、储存及运输10.1包装应选择对人脐带间充质干细胞关键质量属性无影响的袋或瓶中，应选用100毫升0.9%生理盐水袋或瓶。10.2储存10.2.1应符合T/CSCB0001-2022要求。10.2.2应在低于-130℃环境下储存。10.3运输10.3.1应符合T/CSCB0001-2022要求。10.3.2冻存的细胞应在干冰或低于-130℃条件下运输，非冻存细胞建议在2℃~8℃下运输。9T/LNSI008-202411废弃物处理人脐带间充干细胞生产和检测过程中生产的废弃物应按照T/CSCB0001-2022中的规定处理。T/LNSI008-2024（规范性）细胞存活率检测细胞计数法A.1仪器和设备A.1.1明视场显微镜。A.1.2血球计数板。A.2试剂除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为18.2MΩ去离子水。A.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。A.2.2台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。A.3检测步骤A.3.1细胞悬液制备收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个血球计数板（A.1.2）的1mm2的方格中的细胞的数量应为20个~50个细胞。如果高于200个细胞，则需要进行稀释。A.3.2细胞染色按1:1的体积比将台盼蓝染液（A.2.2）与细胞悬液（A.3.1）混合均匀。A.3.3细胞计数将盖玻片盖在血球计数板（A.1.2）计数槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一侧计数室的盖玻片边缘，另取10μL混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静止30s，将计数板置明视场显微镜（A.1.1）下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。对16×25规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个1mm2的中格（即100个小格）计数。对25×16规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下和中央5个中格（即80个小格）计数。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞（或只计数下方和右方线上的细T/LNSI008-2024胞）。按步骤A.3.2~A.3.3在重复测定一个样品。A.3.4细胞存活率计算A.4计算与分析细胞存活率按式（A.1）进行计算：X=(M-S)/X×100%.........................................（A.1）式中：X—细胞存活率；M—细胞总数；S—染色的细胞数。计算两次计数细胞存活率结果的平均值，记为细胞平均存活率。A.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。T/LNSI008-2024（规范性）细胞标志蛋白检测流式细胞法B.1仪器和设备B.1.1流式细胞仪。B.1.2水平离心机。B.1.3电子天平。B.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。B.2.1磷酸盐缓冲液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：纯度≥98%。B.2.3叠氮钠（NaN3）。B.2.4抗人CD105、CD73、CD90、CD11b、CD19、CD31、CD45、HLA-DR抗体及同型对照抗体。B.2.5按照相应要求使用电子天平（B.1.3）配置流式检测所需的液体：洗涤液、抗体稀释液。B.3样品保存洗涤液和标记后的样品于2℃~8℃保存。相关抗体遵照说明书保存。B.4检测步骤B.4.1样品准备收集细胞，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。然后，用洗涤液清洗一遍，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。B.4.2抗体孵育按照抗体说明书进行稀释使用。抗体孵育结束后用洗涤液清洗两遍，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。T/LNSI008-2024B.4.3过滤上机用洗涤液重悬细胞，然后通过40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪（B.1.1）应用手册上机检测。B.4.4圈门设定原则首先根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据Isotype对照组荧光强度，在分群1的基础上画出阳性细胞群2，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。抗体Isotype作为阴性对照。B.5结果分析得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。T/LNSI008-2024（规范性）成骨分化检测茜素红S染色法C.1仪器和设备C.1.1血球计数板。C.1.2明视场显微镜。C.1.3水平离心机。C.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。C.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。C.2.2消化酶。C.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（C.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。C.2.4成骨诱导液。C.2.5茜素红S染色试剂盒。C.3检测步骤C.3.1细胞样品的准备C.3.1.1细胞消化使用水平离心机（C.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。C.3.1.2细胞计数根据附录A方法测定，使用血球计数板（C.1.1）及明视场显微镜（C.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。C.3.2细胞接种并诱导细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成骨诱导液产品说明书，诱导14d~21d。T/LNSI008-2024C.3.3钙结节染色钙结节染色根据茜素红S染色试剂盒说明书进行。C.4结果分析显微镜下可见散在大量橘红色的钙结节。T/LNSI008-2024（规范性）成脂分化检测油红O染色法D.1仪器和设备D.1.1血球计数板。D.1.2明视场显微镜。D.1.3水平离心机。D.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。D.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。D.2.2消化酶。D.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（D.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。D.2.4成脂诱导液。D.2.5油红O染色试剂盒。D.3检测步骤D.3.1细胞样品的准备D.3.1.1细胞消化使用水平离心机（D.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。D.3.1.2细胞计数根据附录A方法测定，使用血球计数板（D.1.1）及明视场显微镜（D.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。D.3.2细胞接种并诱导细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成脂诱导液产品说明书，诱导14d~21d。T/LNSI008-2024D.3.3脂滴染色脂滴染色根据油红O染色试剂盒说明书进行。D.4结果分析显微镜下可见橙红色的脂滴，脂肪细胞中含大小不等的脂滴。T/LNSI008-2024（规范性）成软骨分化检测阿尔新蓝染色法E.1仪器和设备E.1.1血球计数板。E.1.2明视场显微镜。E.1.3水平离心机。E.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。E.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。E.2.2消化酶。E.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（E.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。E.2.4成软骨诱导液。E.2.5阿尔新蓝染色试剂盒。E.3检测步骤E.3.1细胞样品的准备E.3.1.1细胞消化使用水平离心机（E.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。E.3.1.2细胞计数根据附录A方法测定，使用血球计数板（E.1.1）及明视场显微镜（E.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。T/LNSI008-2024E.3.2细胞接种并诱导细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成骨诱导液产品说明书，诱导14d~21d。E.3.3软骨细胞外基质染色软骨细胞外基质染色根据阿尔斯兰染色试剂盒说明书进行。E.4结果分析显微镜下可深蓝色的软骨细胞胞外基质。T/LNSI008-2024（规范性）成瘤性检测免疫缺陷小鼠检测法F.1仪器和设备F.1.1血球计数板。F.1.2明视场显微镜。F.1.3水平离心机。F.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。F.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。F.2.2消化酶。F.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（F.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。F.3检测步骤F.3.1细胞样品的准备F.3.1.1细胞消化使用水平离心机（F.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。F.3.1.2细胞计数根据附录A方法测定，使用血球计数板（F.1.1）及明视场显微镜（F.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。F.3.2细胞移植将1×107个人脐带间充质干细胞注射到6至8周龄的免疫缺陷型小鼠皮下，设置空白对照组（空白组注射与产品对应的溶媒）、阴性对照组（人二倍体细胞）、阳性对照组（人肿瘤细胞系、按照肿瘤T/LNSI008-2024细胞系接种要求的数量注射）。F.3.3肿瘤观察接种后观察16周，每周测量体重、肿瘤大小。若荷瘤小鼠肿瘤超过2000mm3或者肿瘤溃烂或体重下降，可考虑执行人道终点。16周后剥离小鼠身上肿瘤，行大体观察，瘤体称重，计算成瘤率。F.4结果分析成瘤率按式（F.1）进行计算：Z=N/M×100%.................................（F.1）式中：Z—成瘤率；M—接种小鼠总数；N—荷瘤小鼠总数。T/LNSI008-2024干细胞对淋巴细胞增殖抑制检测干细胞共培养法G.1仪器和设备G.1.1血球计数板。G.1.2二氧化碳恒温培养箱。G.1.3水平离心机。G.1.448孔细胞培养板。G.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。G.2.1人脐带间充质干细胞完全培养基。G.2