边境口岸鼠疫检测实验室建设规范第3部分：鼠疫核酸检测实验室

1边境口岸鼠疫检测实验室建设规范第3部分：鼠疫核酸检测实验室本部分规定了边境口岸鼠疫核酸检测实验室建设规范总体要求。本部分适用于边境口岸鼠疫核酸检测实验室建设的要点和管理要求。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB53046生物安全实验室建筑技术规范GB19489实验室生物安全通用要求WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS279鼠疫诊断标准SN/T国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法3人员要求3.1检测人员3.1.1数量要求按照所开展检测项目及标本量，每班次至少有2名专业技术人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。3.1.2资格要求鼠疫核酸检测实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过鼠疫核酸检测技能培训。3.1.3培训要求必须保证检测人员接受岗前培训，通过资格考核；保证在岗专业技术人员每年至少参加两次以上专业学习、培训或演练。3.1.4备案要求从事鼠疫核酸检测的专业技术人员应在卫生检疫主管部门和口岸监管主管部门备案。3.1.5技术能力熟悉鼠疫风险的处置程序，具备实施前期处置的能力；掌握核酸检测设备的操作规程；熟练掌握核酸检测的操作技能；判定检测结果并签发报告。23.1.6个人防护能力掌握个人防护用品种类及要求；掌握生物安全一、二、三级防护水平分级及适用情况；掌握防护用品的穿脱程序。防护方法和装备参照海关总署卫生检疫司编《卫生检疫标准作业指引》（2019版)《第二十一节进出境人员卫生检疫个人防护作业指引》。3.2管理保障人员3.2.1总体要求鼠疫核酸检测实验室配置至少一名管理保障人员；负责实验室日常工作的生物安全监督、检查；能够保障实验室设施、设备持续正常运转；试剂、消毒剂及相关耗材符合专业要求并满足供应；能够进行仪器设备检定校准、日常维护等。为了防止进入污染区的工作人员发生暴露，经过培训的管理保障人员需在穿脱防护用品等生物安全操作过程中给予监督、指导及帮助；管理保障人员需充分知晓如何穿脱防护用品的程序，能够处理发生暴露后的相关事件。3.2.2资格要求管理保障人员需由具备医学背景专业人员、或经过相关专业培训取得上岗资格证书的人员担任，并定期考核换证。3.2.3培训要求管理保障人员需接受岗前培训，资格考核后获取上岗证书；在岗专业人员每年至少参加两次以上专业学习、培训或演练，并在上级卫生检疫主管部门和口岸监管主管部门备案。3.2.4技术能力应做到“三知四会”：知鼠疫相关知识，知鼠疫疫情风险，知业务要求，会选择防护用品，会穿脱，会污染控制，会应急处置。熟悉鼠疫风险的处置程序，具备实施前期处置的能力；掌握核酸检测设备的操作规程；熟练掌握核酸检测的操作技能；判定检测结果并签发报告。3.2.5个人防护能力掌握个人防护用品种类及要求；掌握生物安全一、二、三级防护水平分级及适用情况；掌握防护用品的穿脱程序。3.3考核要求3.3.1生物安全考核操作人员需熟练掌握生物安全相关知识；熟悉生物安全标准操作流程；熟练掌握消毒原则和技术；掌握意外事件和生物安全事故的应急处置原则和上报程序。3.3.2操作培训考核操作人员能够熟练掌握鼠疫核酸检测方法，每年进行至少一次现场采样与核酸检测、医疗废弃物处置、终末消毒的全流程操作考核。4场所、设备、试剂要求4.1场所要求3鼠疫核酸检测实验室场所生物安全需按照GB53046、GB19489和WS233中的有关规定执行，核酸提取过程需在生物安全二级及以上实验室内进行。原则上应当设置试剂储存和准备区、标本制备区、基因扩增区和产物分析区。各个区域在物理空间上应当是完全相互独立的，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。4.2设备要求4.2.1仪器设备类型实验室应当配备与开展核酸检测项目相适宜的仪器设备。生物安全柜（II级）、高压灭菌器、医用冷藏冷冻箱、高速冷冻离心机、核酸提取仪、PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统、实时荧光PCR仪、，辅助设备配备：各量程微量移液器、小型水浴器或干浴器、涡旋混匀器、瞬时离心机等。4.3试剂要求无菌生理盐水或三蒸水、全自动核酸提取仪配套试剂、引物、反应体系、阳性对照、阴性对照、探针。商品化核酸检测试剂盒应选择在国家食品药品监督管理局通过注册审批的产品。4.4检测方法4.4.1聚合酶链式反应（PCR)检测4.4.1.1核酸提取用商品化的DNA提取试剂盒提取核酸，具体操作参见该试剂盒说明书。4.4.1.2目标基因从疑似鼠疫的血液标本中检测鼠疫菌特异性基因，以fra和pla二基因的片段作为目标基因。4.4.1.3反应体系一次总量25μL反应混合物如下，采用其他总量时，配方按比例改变。——10xbuffer——dNTPs——Fra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）——Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）——Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）——Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）——Taq聚合酶——内部对照模板——待检测模板（基因组DNA）——去离子水44.4.1.4扩增条件预变性95℃,5min，1个循环；然后变性95℃,1min，退火55℃,1min，延伸72℃,1min，30个循环；最后保持72℃,5min。共1小时40分。4.4.1.5电泳检测及结果判读制备1%琼脂糖凝胶放入电泳槽电泳。预期扩增片段大小：fra:249bp和pla:456bp。在阴阳性参考均正常的条件下，PCR产物片段应与预期扩增片段大小一致，判定为阳性。4.4.1.6测序将PCR扩增产物进行测序分析后获得基因序列，再与Genbank数据库相应序列进行比对而获得结果。4.4.2荧光定量PCR检测4.4.2.1核酸提取用商品化的DNA提取试剂盒提取核酸，具体操作参见该试剂盒说明书。4.4.2.2目标基因可选择检测鼠疫菌特异性基因fra1或co392基因的片段作为目标基因。4.4.2.3操作方法选择检测限低、灵敏度高的检测试剂盒。根据试剂盒说明书配置反应体系，按照实际机型进行反应程序设置、基线和对照设置，将加好样的PCR反应管分别转移到荧光PCR检测仪上进行扩增反应。4.4.2.4质量控制每批检测必须有阴、阳性质控和空白对照。阳性质控测定为阳性，阴性质控测定为阴性，视为在控；反之，则为失控，不可出具检测报告，需重新复检标本或重新采样。4.4.2.5结果判定依据所用试剂说明书，在实验有效的情况下，根据荧光增幅曲线和循环阈值（Ct)作出判断。5样本采集、保存、运输5.1样本采集血液：血液样本采集双份样本：无抗凝剂（红管）血液2管，5毫升/管；EDTA抗凝剂（紫管）2管，2毫升/管，用于实验室检测及送样。具体操作见海关总署卫生检疫司编《卫生检疫标准作业指引》（2019版）《第九节进出境人员生物样本采集、送检作业指引》附件4《采样操作指南》。5.2样本保存核酸检测的样本应当尽快进行检测，血清标本可在24小时内于4℃冷藏存放，-20℃以下可长期保存。应当设立专库或专柜单独保存样本。5.3样本运输5样本运输按照海关总署卫生检疫司编《卫生检疫标准作业指引》（2019版）《第九节进出境人员生物样本采集、送检作业指引》附件5《高致病性病原微生物相关感染性标本的包装运输》要求进行，样本采集后应当尽快送往实验室，室温（25℃)放置不宜超过4小时。如果需要长途运输，建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。6阳性结果的处置6.1报告：迅速报告现场负责人6.2样品转运专业实验室复核样品按照《可感染人类