DB34∕T 2562-2015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法(ELISA)

大曲酯酶活力的检测酶联免疫法(ELISA)HYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、刘国英、汪君、李红歌、马侠。1大曲酯酶活力的检测酶联免疫法(ELISA)本标准规定了大曲酯酶活力的检测酶联免疫法。本标准适用于大曲酯酶活力的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。酯酶活力单位esteraseactivityunit在37℃、pH6.0条件下，15min水解α-乙酸萘酯转化为α-萘酚，每产生1nmolα-萘酚为1个酯酶活力单位(U)。HYPERLINK试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。HYPERLINK5试剂和材料5.1本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水。5.2酯酶试剂盒：2～8℃冰箱中保存。5.2.1包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。5.2.2羧酸酯酶标准品：450U/L。5.2.3羧酸酯酶标记物。5.2.4羧酸酯酶标准品稀释液。5.2.5试样稀释液。5.2.6洗板母液。25.2.7显色剂A。5.2.8显色剂B。5.2.9反应终止液。5.3磷酸二氢钠(NaH₂PO4·2H₂O):优级纯。5.4磷酸氢二钠(Na₂HPO4·12H₂O):优级纯。5.5氯化钠(NaCl):优级纯。5.6磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取0.62g磷酸二氢钠(5.3)、5.73g磷酸氢二钠(5.4)和9g氯化钠(5.5),加水溶解至1000mL,在pH计上调节溶液pH=7.4。5.7羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒(5.2)的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液(5.2.4)将羧酸酯酶标准品(5.2.2)稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。5.8洗涤液：将洗板母液(5.2.6)按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。6仪器和设备6.1酶标仪(配备450nm滤光片)。6.2分析天平：感量1mg6.3冷冻离心机。6.4振荡器。6.5恒温培养箱。6.6超声波细胞破碎仪。7测定步骤7.1粗酶液制备7.1.1称取0.1～0.5g试样，精确到0.001g,置于100mL烧杯中，加50mL磷酸盐缓冲溶液(5.6),振荡10min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪(6.6)中，超声探头直径6～8mm、超声温度4～8℃、超声时间3～5s、间歇时间3～5s、超声功率300～350W、总超声时间5～10min,制成试样液。7.1.2试样液于4～8℃、5000r/min离心10min,取1mL上清液于250mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液(5.6)至刻度，摇匀，制成粗酶液。保存过程中如有沉淀，应再次离心。7.2测试程序流使用，请勿传播或其他用途7.2.1以下所有操作应在20～25℃室温下进行。7.2.2酶标仪测定条件：酶标仪测定波长450nm。7.2.3酯酶试剂盒(5.2)中所有的试剂的温度均应回升到室温(20～25℃)后方可使用。7.2.4洗板条件7.2.4.1人工洗板次数5次以上，每次注水量250μL。7.2.4.2自动洗板可以设定5个周期。7.2.5记录空白、标准品和试样在微孔板上的位置。37.3.1吸取50μL羧酸酯酶标准工作溶液(5.7)依次加入标准溶液孔底(5.2.5)加入试样孔底部，再加10μL粗酶液(7.1),混合均匀。7.3.2封板膜封板后置于37℃恒温培养箱(6.5)中孵育30min。7.3.3取出微量反应板，弃去液体，甩干，立即用洗涤液(5.8)按7.2.4条件进行洗板，每次静置7.3.4吸取50μL羧酸酯酶标记物(5.2.3)于空白孔外的每一个微孔。用封板膜密封孔口，于37℃孵育30min。7.3.5按7.3.3步骤重复操作。7.3.6加入50μL显色剂A(5.2.7)和50μL显色剂B(5.2.8)于每一个微孔底部，摇匀后于37℃孵7.3.7迅速加入反应终止液(5.2.9)50μL于每一个微孔底部，摇匀(此时蓝色立转黄色)。7.3.8将微量反应板置于酶标仪(6.1)中，在450nm处用空白孔调零点，测定吸光度(加入反应终止7.4平行试验7.5空白试验8结果计算以吸光度值为纵坐标，酯酶的活力(U/L)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的酯酶活力，结果按公式(1)进行计算。...................