3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修32

1.“分子手术刀”——1）来源：

2）作用：

3）作用结果：2.“分子缝合线”——1）作用：

2）分类：3.“分子运输车”——1）作用：

2）种类：

3）应具备条件：

限制酶

产生黏性末端、平末端

DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来磷酸二酯键将外源基因导入受体细胞，并在受体细胞内复制质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害——便于重组DNA分子的筛选——供外源DNA片段（目的基因）插入其中课前提问第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序（4课时）

本节聚焦基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？苏云金杆菌

普通棉花（无抗虫特性）3.将目的基因导入受体细胞

棉花细胞转基因抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）4.目的基因的检测与鉴定情境再现与载体拼接

你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？(P76第3段)P77相关信息2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定1.目的基因的筛选与获取基因工程的基本操作程序有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。

第2节

基因工程的基本操作程序1.什么样基因才能称为目的基因？举例说明？2.筛选合适的目的基因的方法？3.明确目的基因后，该如何获得它？

任务：阅读教材76-77，解决问题：第一步：目的基因的筛选和获取主要指的是编码蛋白质的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选①

；②

；③

。人工合成利用PCR获取和扩增目的基因（常用）构建基因文库（P82第5段第1、2行)利用PCR获取和扩增目的基因：任务：阅读教材77-79，解决问题：1.PCR的全称？2.PCR是一项怎样的技术（概念）？（据概念分析）PCR依据的原理？操作环境？优点？3.回忆体内DNA复制需要什么条件？

从而分析PCR需要哪些条件？4.PCR的过程？DNA半保留复制

体外短时间内大量扩增目的基因聚合酶链式反应参与组分在DNA复制(体内)中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物不用，用高温代替DNA模板(目的基因)4种脱氧核苷酸提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）2种引物PCR所需的基本条件：

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。P77相关信息需要在一定的缓冲溶液中才能进行P77相关信息（一般要添加Mg2+:激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）1.原理：DNA半保留复制2.条件：①模板（目的基因）、②2种引物、③4种脱氧核苷酸、④耐高温的DNA聚合酶、⑤缓冲溶液（含Mg2+)3.过程：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’①变性②复性③延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶PCR（聚合酶链式反应）教材77-781）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。PCR反应的过程2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。3’3’PCR反应的过程引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。由于DNA双链是反向平行的，两端碱基序列不同，所以需要两种引物3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端PCR反应的过程要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列优点：可以在短时间内大量扩增目的基因

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。PCR（聚合酶链式反应）由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2n常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。4.PCR的结果：5.PCR产物的鉴定：循环n次，理论上可获得DNA数

，

其中含引物的DNA数

，含引物的DNA链数

，共需引物数

。2n2n2n+1-22n+1-2利用PCR获取和扩增目的基因5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’问题探究：（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段）？（2）如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。2n+1－22n－1

1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？2.引物在PCR中能重复利用吗？使用的一对引物的序列相同吗？3.

PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？4.PCR过程是否需要ATP供能？氢键不需要解旋酶，需要90℃以上的高温不能不需要，由dNTP水解供能不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列*两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增4种脱氧核苷酸【实际上是4种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）】，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。思考·讨论6.新冠病毒的遗传物质是RNA，核酸检测能用PCR直接扩增它的RNA吗？应先将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。思考·讨论PCR不能直接扩增RNA(P79旁栏思考)7.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。拓展资料——引物设计原则P77：1.长度适当（20-30bp）；2.引物内部不发生碱基互补配对；3.引物之间不发生碱基互补配对；4.GC含量适宜。cDNA3.下图表示PCR扩增的产物,则它是哪次循环的产物()

A.第一次循环 B.第二次循环C.第三次循环 D.第四次循环A金榜学案P97【课堂练习】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特异地复制处于

之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了

轮的DNA复制。（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是

。两个引物从子链的5′端向3′端延伸5引物甲、引物丙62个引物=形成62条新单链=31个新DNA，加上原有的模板DNA，现在一共有32个DNA，即复制5次的结果。

25拓展资料——引物设计原则P77：1.长度适当（20-30bp）；2.引物内部不发生碱基互补配对；3.引物之间不发生碱基互补配对；4.GC含量适宜。A完成课时评价作业（十三）2、3、4；金榜P97，第3、4、5，预习后面三个操作程序解旋酶加热超过90℃氢键该DNA聚合酶在高温下会失活细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰90℃以上PCR小结目的基因的筛选与获取一受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶(1)过程：（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出

个DNA片段，共需要引物数量为

个。指数2n2n＋1－2(2)DNA复制方向：

。5’端→3’端思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？

①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。

②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表达载体构建PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。02第二步：基因表达载体的构建---核心工作4.基因表达载体的构建过程任务：阅读教材P80，解决问题：第二步：基因表达载体的构建(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；(2)同时，使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.载体和基因表达载体的区别？

为什么要构建基因表达载体？3.基因表达载体应该具备什么结构才能到达以上目的？

各个结构的作用？目的基因插入什么位置？1.获取目的基因后，如何导入受体细胞吗？需借助载体（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。①目的基因＋②启动子＋③终止子＋④标记基因+⑤复制原点二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）1.基因表达载体的目的2.基因表达载体的组成思考：要各个元件有什么作用？教材P80（1）启动子：①本质：一段有特殊序列结构的

片段。DNA②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。表达载体③启动子①目的基因④终止子⑤复制原点（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的

片段。②功能：使转录在所需要的地方停下来。DNA2.基因表达载体的组成二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）②标记基因教材P80启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)金榜P91（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。启动子终止子标记基因复制原点目的基因主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子

终止子（4）目的基因：二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）教材P80二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）3.基因表达载体的构建过程③再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到

的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。目的基因限制酶切割位点标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶限制酶DNA连接酶①首先用一定的

切割载体（质粒），使它出现一个切口。②然后用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶同种相同DNA连接酶载体教材P80培育抗虫棉的简要过程载体①自身环化②片段间的连接目的基因自身环化质粒自身环化目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接

反向连接目的基因11’22’122’1’22’1’1如何解决这一问题？

思考：如果用同一种限制酶（单酶切）分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)双酶切！3种同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。限制酶a切割abDNA连接酶连接限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割abP80旁栏思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便么？如果这样做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。知识扩展：限制酶的选择原则(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因

相同或可产生同种末端的限制酶切割质粒，如图中

；

为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择

和

两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择

，而不选择

。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ金榜P91基因表达载体的构建PCRDNA半保留复制启动子RNA聚合酶标记基因C金榜P91A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNAD.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的

培养基上生长√4.(2023·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞思考03第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞②农杆菌转化法（常用）①花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（我国科学家独创)三（双子叶植物、裸子植物)（受体细胞：受精卵)（受体细胞：原核细胞，常用大肠杆菌)阅读教材P81和P82倒数1.2段，归纳导入方法三、将目的基因导入受体细胞

（

使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）（1）花粉管通道法(我国独创)①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊适用植物：开花植物三、将目的基因导入受体细胞教材P81第一段（一)将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法体细胞或受精卵该方法受体细胞为

。“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。①农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功（一)将目的基因导入植物细胞教材P81资料卡第一二段三、将目的基因导入受体细胞③具体过程：构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒表现出新性状的植株导入植物细胞植物细胞将目的基因插入染色体DNA中目的基因Ti质粒T-DNA含重组Ti质粒的农杆菌转入农杆菌农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞教材P81资料卡导入1.将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法③过程：两次拼接和两次导入a.两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞

上。b.两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入

；

第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的

导入受体细胞。T-DNA染色体DNAT-DNA农杆菌金榜学案P94三、将目的基因导入受体细胞a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；受体细胞为_______与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵三、将目的基因导入受体细胞（一)将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法④导入的具体方法：教材P81资料卡1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养问题探讨单子叶植物将目的基因导入植物细胞染色体DNA

T-DNADNA连接酶、限制酶花粉管通道法学案P93D学案P93三、将目的基因导入受体细胞2.将目的基因导入动物细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：①体积大，易操作；

②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（3）过程：（目的？）（2）受体细胞：（优点？）繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA增加细胞膜的通透性一般利用温度变化导入将目的基因导入受体细胞的方法总结细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射Ca2＋处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中完成课时评价作业P37第1、5、6、7、11-15在棉花细胞中，如何判断重组表达载体是否导入成功？即使导入成功，如何判断是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？1.分子水平检测2.个体水平鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR技术或分子杂交技术抗原-抗体杂交技术教材P82第四步：目的基因的检测与鉴定方法1：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作是否扩增出目的基因电泳操作M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA半保留复制原理：1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因第四步：目的基因的检测与鉴定教材P82一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。基因探针：原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：教材P822.检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或DNA-RNA分子杂交技术RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图Bt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳（一)分子水平的检测用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。第四步：目的基因的检测与鉴定教材P82③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：

抗原与抗体的特异性结合原理：苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带抗原—抗体杂交技术第四步：目的基因的检测与鉴定教材P822.个体生物学水平鉴定没有抗虫基因的棉花植株有抗虫基因的棉花植株棉铃虫没有死亡棉铃虫死亡接种棉铃虫四目的基因的检测与鉴定以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）转Bt基因非转基因教材P82饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等4、个体水平鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定教材P82例4】(2021·广州)下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述,错误的是()A.如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质,可确定目的基因上游含有启动子B.检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录的方法都是分子杂交法C.目的基因的鉴定通常是在个体水平上进行的D.目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入细胞质DNA中学案P93D8.下列技术依据碱基互补配对原理的是()①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译产生蛋白质④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性A.①②③④

B.①②

C.①②④ D.①②③9.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白BD课时评价（13）4.(2021·佛山)实时荧光RT-PCR技术可快速检测新型冠状病毒的核酸。检测原理如图所示,探针是含荧光基团并有特定序列的DNA单链。下列说法错误的是()

A.逆转录和杂交DNA扩增所需的原料相同B.逆转录、扩增和分子杂交中碱基配对情况相同C.病毒RNA的遗传信息通过逆转录传递给单链DNAD.逆转录和杂交DNA扩增所需酶种类不同B课时评价（13）1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（

）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（

）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）√××练习与应用(P83)2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述

错误的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D一、概念检测研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。二、拓展应用外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践实验原理（1）DNA片段的扩增①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。（2）DNA片段的电泳鉴定①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。教材P84如何对PCR扩增产物进行鉴定？思考讨论琼脂糖凝胶电泳原理：

较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。－最短最长教材P848.(2021·天津)下列有关电泳的叙述,错误的是(

)A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定9.(2022·辽宁)染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白,对得到的DNA片段进行凝胶电泳,结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理,则得到随机长度的DNA片段。据此分析,下列有关叙述错误的是()A.凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关C金榜P98C7.若用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是()A.图中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA金榜P98D16.(2023·广东)为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响,研究人员在种植转基因菊花的第二年,随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草,提取DNA。根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,电泳结果如图。回答下列问题。(1)将外源基因Vgb整合到菊花细胞需要先构建基因表达载体,构建基因表达载体时,需要使用的酶有

。重组载体进入菊花细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为

。构建基因表达载体时,外源基因Vgb插在启动子的上游,则在菊花细胞中检测不到表达产物,主要原因是

。

(2)设计引物是PCR技术的关键步骤之一,根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)为,此引物设计(填“合理”或“不合理”),理由是

(3)设置空白对照的目的是

。对于外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对周边植物的影响方面,图中实验结果表明

。

限制酶和DNA连接酶转化目的基因无法转录引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效不合理排除实验操作、试剂污染等对结果的影响2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定存在,且未发生向周边植物的扩散12.(2023·新课标Ⅱ卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接C课时评价（13）电泳实验视频探究·实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理：DNA的热变性原理;DNA半保留复制的原理。2.DNA片段的扩增过程：移液用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分

离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）反应参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。完成金榜学案P97-98，1-11题(4)如何对PCR产物进行鉴定？琼脂糖凝胶电泳P84必修二P52DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。最长最短泳动方向从上到下，最短的跑在前面，最长的跑在最后。1列就是1条泳道。制备凝胶①融化②倒模③凝固用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。进行电泳①加液②加样③电泳将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察鉴定取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。2.DNA片段的电泳鉴定过程P85·1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。P85·2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？（2）如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：模板DNA出现污染;TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;Mg2+浓度过高;退火温度(复性时的温度)过低;等等。转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果(M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；)DNA标准样液(Marker)阳性对照阴性对照待测样品阴性对照：用于检测是否存在含有其他序列的DNA污染。模板DNA的制备引物的质量与特异性酶的质量PCR循环的条件(1)未出现扩增条带可能的原因有:模板DNA含有杂蛋白；TaqDNA聚合酶失活；引物出现质量问题；引物浓度不合适；TaqDNA聚合酶的抑制剂；Mg2+浓度过低;变性温度过低;变性时间过短;目的序列改变;等等。1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。（四）注意课本P85探究·实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定总结1.目的基因的筛选和获取利用PCR获取和扩增化学方法人工合成